转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5对大型蚤(Daphnia magna)的生态毒性研究

张莉，韩娟, 刘标,*

1. 环境保护部南京环境科学研究所，环境保护生物安全重点实验室，南京 210042 2. 农业部食物与营养发展研究所，北京 100081

玉米作为重要的粮食和饲料作物，在中国乃至世界农业生产上都占据重要地位。玉米原料及其加工过程的副产品，如玉米油、玉米蛋白粉、玉米胚芽粕等是很多水生动物重要饲料来源[1-3]，为水生动物生长提供营养和能量。

玉米在其巨大需求的同时，也面临着虫害、杂草等诸多减产因素。转基因玉米的问世缓解了玉米供不应求的突出矛盾，为玉米粮食安全做出巨大贡献。截止到2007年，国外至少有40种转基因玉米通过安全评估并批准释放，用于食品和饲料的原材料[4]，自2010年始，我国也批准进口转基因玉米用于饲料加工。

转基因玉米在降低生产成本、提高产品品质方面，显示出独特的技术优势和全新的开发前景，与此同时，其对环境和人类健康造成的潜在生态风险不容忽视。由于转入的外源基因并非作物本身基因库的基因，外源基因的插入引发的非预期效应可能对宿主细胞代谢产生影响，甚至产生一些新的代谢产物[5-6]，进而引发一些潜在或尚不可预见的后果，因此使用动物喂养试验来评价其安全性非常必要[7]。现有的关于转基因玉米饲喂试验主要集中于一些哺乳动物上[8-10]，而动物饲喂试验往往存在着试验周期长、成本高等诸多不足[11]，且大部分饲喂试验时间选择的是实验动物生命周期的某一阶段[12]，这个时间段相比动物寿命来说都比较短，而实际上转基因产品或饲料对动物的影响可能是以低浓度长期作用的方式进行的[13]。另外，幼龄的实验动物可能对受试物更为敏感，因此使用动物饲喂试验对转基因作物及产品进行安全评价时有必要同时关注试验动物的幼龄期和成龄期2个时间段[14]。

一些研究者发现，包括转基因玉米在内的一些转基因作物在自然栽培过程中，作物花粉、根系分泌物、碎屑物等会随环境变化进入农田周围的自然水域(如池塘、湿地、人工/天然溪流等)[15-16]，进而使邻近水域中的水生生物接触到外源蛋白。Douville等[17-18]在对转cry1Ab基因玉米的研究时发现，转cry1Ab基因玉米田周边水域的表面水、沉积物以及河蚌组织内检测到cry1Ab基因存在，由此可见转基因玉米对水生生态系统造成的潜在生态风险不容忽视。

大型蚤(Daphniamagna)，属于枝角类水生生物，其生活周期短、繁殖快、易于实验条件下培养且对污染物敏感[19-20]，其生存和繁殖能力试验通常被视为水生环境监测的常规方法[21]。转基因作物成功培育后，许多研究者将大型蚤应用于外源蛋白[22-24]、花粉[25]、饲料[13,26]等安全性评价中，这些研究为以大型蚤为试验动物测试转基因材料安全性提供了方法参考。水产养殖越来越多地使用转基因材料也越发突出了研究和评价转基因材料饲料安全性的重要性[13]。

中国和欧盟等国家和地区都要求对新开发的转基因作物品种进行亚慢性毒性实验，抗虫和耐除草剂玉米C0030.3.5作为新的转化体，其安全性仍需要根据个案评估的原则进行食用安全性评估，且C0030.3.5同时具有抗虫和和耐除草剂2种特性，目前同时表达2种外源蛋白的转基因产品对水生生物的食用安全性的评价还鲜见报道。本研究以C0030.3.5玉米为唯一食物来源饲喂大型蚤，在大型蚤生命周期内评价C0030.3.5对其生长和繁殖的影响，以期为评估转基因玉米作为饲料的安全性提供科学参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

供试材料为北京大北农科技集团股份有限公司提供的抗虫和耐除草剂双价转基因玉米C0030.3.5(外源基因cry1Ab和epsps)籽粒及其亲本DBN318玉米籽粒。玉米籽粒使用TC-10型超音速气流粉碎分级机进行低温粉碎，粉碎后的玉米粉粒径10～15 μm，符合大型蚤对食物粒径的需求[11,27]。采用随机抽样方法对玉米粉进行营养成分测定(n=3)，经测定，2种玉米粉在蛋白质、脂肪、淀粉以及主要矿物质元素上含量一致(P>0.05)，具体营养成分见表1。采用玉米Cry1Ab和EPSPS检测试剂盒(Envirologix)对随机选取的10份C0030.3.5和DBN318玉米粉进行Cry1Ab和EPSPS蛋白含量测定，结果显示C0030.3.5玉米粉2种蛋白的表达量分别为1.49(±0.33 SD) μg·g-1和35.42(±0.89 SD) μg·g-1，DBN318检测结果均显示阴性。

1.2 供试大型蚤

本研究选用的大型蚤引自环境保护部南京环境科学研究所，在本实验室长期培养驯化，选择培养3代以上遗传背景相同、行动活泼的6～24 h的孤雌生殖的幼蚤作为实验蚤。为测试受试大型蚤的敏感性和实验操作步骤的统一性，以重铬酸钾K2Cr2O7为敏感性测定毒物，按照GB/T13266—1991方法[28]测定大型蚤的敏感性。经测定，20 ℃时重铬酸钾的24 h半数效应浓度(24 h-EC50)为0.922 mg·L-1，符合大型蚤的敏感性要求(0.9～1.7 mg·L-1)，可以作为标准试验生物进行实验。

1.3 试验方法

试验设置小球藻(Chlorellavulgaris)组、DBN318玉米粉组和C0030.3.5玉米粉组3个处理，每处理3个重复，每重复10头大型蚤。实验选用100 mL烧杯，每杯盛放80 mL M4培养溶液[29]，并随机放置1头幼蚤。试验过程中，小球藻组每日饲喂一次浓缩藻液，喂食终密度约为5×105个·mL-1，DBN318玉米粉组和C0030.3.5玉米粉饲喂1.5 g·L-1的相应的玉米粉 1 mL。每天定时观察大型蚤的生长繁殖情况，同时记录各处理组大型蚤存活情况，统计大型蚤存活时间。实验中每3天更换一次培养液，每次换培养液的同时，测定大型蚤的体长(从头部到壳刺基部)。当大型蚤开始繁殖后，记录首次繁殖时间、实验期间累积产幼蚤总数，并使用前端处理过的3 mL巴氏吸管将新生幼蚤移出。试验在温度(22±1) ℃，光强为60 μmol·m-2·s-1，光暗比为16 h: 8 h的恒温培养室(Binder，KBF720，德国)中持续28 d。

1.4 数据处理

采用Excel 2003统计分析软件进行数据整理，试验数据以平均值±标准差(x±SD)表示，Sigmaplot 10.0绘图。使用SPSS 17.0软件ANOVA程序进行单因子方差分析，Tukey’s test 进行多重比较，以P<0.05作为统计学上检验的显著性水准。

2 结果(Results)

2.1 绿藻组大型蚤

实验中小球藻组大型蚤作为空白对照验证试验过程的有效性[28]，至21 d时小球藻组存活率为80%，新生幼蚤98头，试验期间未有卵鞍出现，符合大型蚤生长和繁殖试验的需求[28]。小球藻组大型蚤存活率、体长情况如图1、图2所示，繁殖参数列入表2。

2.2 存活率

图1显示的是小球藻组、亲本玉米DBN318组和抗虫耐除草剂玉米C0030.3.5组实验蚤28 d存活率变化情况(图 1)。实验过程中，2个玉米粉组试验蚤随实验天数的增加均有一定的死亡。方差分析显示C0030.3.5组大型蚤和亲本DBN318组大型蚤存活率没有显著性差异(P>0.05)。

表1 C0030.3.5与DBN318玉米营养成分分析Table 1 Comparison of main components in maize seeds between C0030.3.5 and its parental line DBN318

注: 表内数据均为“平均值±标准差”(n=3)，同一行数据右上角字母不同，表示差异显著(P<0.05，独立样本t检验)；字母相同表示差异不显著 (P>0.05)。Note: The values in the table are the mean ± standard deviation (n=3). Values in the same row with different superscripts represent significant difference (P< 0.05,t-test); values in the same row with same superscripts are not significantly different (P>0.05).

2.3 体长

不同食物条件下大型蚤的体长表现不同(图2)。小球藻组试验蚤体长在1～10 d内增加明显，11 d后缓慢增长，至实验结束时(28 d)小球藻组平均体长3.79 mm。对于DBN318和C0030.3.5玉米粉组试验蚤，28 d试验期内，2个玉米粉组试验蚤体长在整个实验期内增长模式大体一致，第3～28天期间，C0030.3.5玉米粉组大型蚤体长与亲本玉米粉组的相比，没有显著性差异(P>0.05)，至28 d时，DBN318和C0030.3.5玉米粉组大型蚤平均体长分别为2.54 mm和2.65 mm，统计学检验显示两者无显著性差异(P>0.05)。各组大型蚤体长随时间变化情况见图2。

2.4 繁殖

不同食物饲喂处理对大型蚤的繁殖指标影响见表2。相对于小球藻组，2个玉米粉组大型蚤均表现出一些繁殖劣势，如首次繁殖时间滞后、首次产幼蚤数较少、累积新生大型蚤总数较少，这些参数与小球藻组有显著性差异，说明仅饲喂玉米粉食物会对大型蚤的生殖量产生一定影响。不过，抗虫耐除草剂玉米C0030.3.5和亲本玉米DBN318玉米米粉组大型蚤在首次幼蚤繁殖时间、首次产幼蚤数及新生小水蚤总数上均没有显著性差异(P>0.05)。

3 讨论(Discussion)

随着生产加工中越来越广泛地使用转基因作物作为饲料原料，对转基因作物及产品可能存在的安全问题进行动物饲喂试验评估已是转基因作物环境安全评价的重要内容。本研究以抗虫耐除草剂转基因玉米C0030.3.5为食物来源饲喂大型蚤，评价其对大型蚤安全性。研究表明与饲喂DBN318亲本玉米粉的大型蚤相比，C0030.3.5玉米粉组大型蚤在体长、存活率及繁殖等方面与常规玉米没有显著性差异，说明C0030.3.5转基因玉米粉并没有引起大型蚤在生长和繁殖方面的不良反应，摄入转基因玉米粉并不会对大型蚤产生不利影响。

在使用C0030.3.5玉米粉和其非转基因对照DBN318玉米粉饲喂大型蚤28 d试验过程中，C0030.3.5转基因玉米粉并没有引起大型蚤在生长和繁殖方面的不良反应。与我们研究结果不同的是，Bøhn等[11]使用抗虫MON810玉米种子、Cuhra等[13]使用抗农达大豆粉(Roundup-ready soyben)进行研究，结果显示转基因成分对大型蚤有一定的副作用。Holderbaum等[30]的研究也表明，食用MON810玉米叶子对大型蚤有显著的慢性不良影响，研究者指出，食用MON810玉米叶的大型蚤相比于对照组表现为体型的减小，生活史中后期阶段的累积繁殖速率降低，最显著的差异为卵鞍生产增加了3.5倍(卵鞍是对胁迫的一种响应)，具有明显的生物学效应。在Holderbaum等[30]的研究中，研究者使用的MON810玉米叶Cry1Ab蛋白表达量高达2 530 ng·g-1，Bt蛋白浓度是C0030.3.5玉米粉的2倍，这或许表明大型蚤生活史的差异与食物材料和外源蛋白的浓度有一定关联。

图1 饲喂不同饲料大型蚤的存活率变化Fig. 1 Survival rate of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris, DBN318 maize and C0030.3.5 transgenic maize

图2 饲喂不同饲料大型蚤体长变化Fig. 2 Mean body sizes of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris, DBN318 maize and C0030.3.5 transgenic maize

表2 饲喂不同饲料大型蚤的繁殖指标Table 2 Fecundity of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris, DBN318 maize and C0030.3.5 transgenic maize

注: 表内数据以“平均值±标准差”表示，同一列内具有相同字母表示差异不显著，不同字母差异显著(Tukey’s test,P<0.05)。Note: Data presented are Means ± SD, means with different superscripts in the same line are significantly different (Tukey’s test,P<0.05).

一些研究表明，食物品质较低时可能对D.magna产生多方面影响，如生长速度较小[31]、首次繁殖推迟[32]以及繁殖力下降[33]等。在本研究中，与小球藻组相比，2个玉米粉组均出现了体长较小、首次繁殖滞后以及总繁殖量降低的情况，由于这些现象在转基因和非转基因玉米粉组均有出现，且二者在这些指标上并没有显著性差异，我们推断摄入转基因玉米粉并不是大型蚤适应性变化的原因，小球藻组和玉米粉组在生长和繁殖上的差异可能是由于食物品质不同造成的。对大型蚤来说，玉米粉可能并不是一种高品质高营养的食物，单纯的玉米粉可能会导致大型蚤生长出现营养不良、食物利用效率低或者其他不利情况。虽然玉米粉组大型蚤生长和繁殖的表现在某种程度上是可预料的，但实验中没有在玉米粉中添加绿藻等天然食物来提高大型蚤的生存活力，这是因为枝角类动物对食物的摄入主要是基于食物粒径而不是气味或硬度[34-35]，混合其他食物(如绿藻)后，大型蚤可能会同时摄入绿藻和玉米粉，从而影响对玉米粉的取食，另外使用玉米粉作为大型蚤生长繁殖的唯一能量来源，可使大型蚤最大限度的接触、暴露于C0030.3.5转基因玉米中。

C0030.3.5作为新近研发的转基因玉米品种，同时表达抗虫和耐除草剂2种外源蛋白，而目前评估表达多种外源蛋白的转基因产品安全性的方法还在探索之中，鉴于一些仅表达抗虫性状或耐除草剂性状的转基因作物对大型蚤及某些水生生物具有一定影响[11, 13, 36-38]，因此在对表达多种外源蛋白的转基因产品安全性评估过程中，同时探究外源蛋白是否单独或者同时对一些非靶标生物产生影响，外源蛋白之间、外源蛋白与玉米内源蛋白质之间是否存在一些相互作用，有助于得出更为准确评估结果，另外，我们评价转基因玉米粉对大型蚤的亚慢性毒性试验仅在大型蚤一个世代内进行，一代之内有些不良效应或某些基因水平的改变可能尚不明显，增加传代次数往往可以把一些微小变化所产生的影响表现出来，因此今后可进行多代繁殖试验，以达到更为全面的评估结果。