姜黄素预处理对干热环境大鼠骨骼肌组织学及超微结构变化的影响*

张东辉 薛晓玉 谢 志 唐 军 李建瑛 许 琴是文辉 李佳佳 董 翔 马 娜 宋来阳 刘江伟

(新疆军区总医院新疆特殊环境医学重点实验室，乌鲁木齐 830000)

肌纤维类型最早发现于1673年，Loranzini 认为动物骨骼纤维有红色与白色之分；随后，Ranvier 在 1883 年正式提出红色的骨纤肌(简称红肌)和白色的骨纤肌(简称白肌)功能 有所不同，并利用电刺激方法证明了这一理论。近期研究发现持续高温应激可以诱导红肌纤维向白肌纤维转化。对于在41 ℃干热环境中大鼠的骨骼肌是否也会出现红肌转化为白肌的热应激反应，本课题组前期研究发现姜黄素(curcumin)能够延长沙漠干热环境中暑大鼠的生存时间[1]。我们推测姜黄素在大鼠骨骼肌热应激反应中能够起到一定作用。本次研究主要观察在姜黄素作用下沙漠干热环境中大鼠骨骼肌组织学和超微结构的变化，为姜黄素在干热环境中暑的防治应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验环境

新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供6～8周龄雄性SPF级SD大鼠200只，体质量220～260 g，实验动物生产合格证号[SCXK(新)2011-0001]。大鼠自购入后于新疆军区总医院实验动物科SPF环境独立通气笼中适应性饲养一周，饲养环境保持温度25 ℃，相对湿度45%，饲料经辐照处理，饮水经高温灭菌处理，大鼠自由摄食和饮水。

1.2 仪器与试剂

西北特殊环境人工实验舱(新疆军区总医院研制)、全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,BS-180)、电子称(上海仪器厂，精确度:0.1 g、量程:1 000 g)、分析天平(上海仪器厂，精确度:0.1 mg、量程:220 g)、BI2000医用图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)。姜黄素(东京化工业株式会社，天然物(CI-75300))、羧甲基纤维素钠(上海源叶生物科技有限公司，300-800mpa.s)，肌红蛋白测定试剂盒(北京利得曼生化技术有限公司，生产批号：201501071)

1.3 实验分组

将200只健康雄性大鼠随机分为5组： ①对照组(盐水组)：正常饲喂，不做预处理；②羧甲基纤维素钠溶剂组(溶剂组)：用5 g羧甲基纤维素钠+蒸馏水定容到1 000 mL配成0.5%的羧甲基纤维素钠溶液；③姜黄素低剂量预处理组：用姜黄素5 mg/100 g+0.5%羧甲基纤维素钠溶液④姜黄素中剂量预处理组：用姜黄素10 mg/100 g+0.5%羧甲基纤维素钠溶液，⑤姜黄素高剂量预处理组：用姜黄素20 mg/100 g+0.5%羧甲基纤维素钠溶液。以上各组按照1 mL/100 g体质量灌胃，连续灌胃7 d，1次/d。

1.4 模型建立及取材方法

特殊环境人工实验舱内将沙漠干热环境设定为(41±0.5)℃，相对湿度(10±1)%，大鼠进舱前，禁食12 h，可随意饮水。大鼠进舱后禁食禁水，不麻醉，可在笼内自由活动。按0 min、50 min、100 min、150 min时间点从舱中取出大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠，麻醉大鼠，剪开腹腔，下腔静脉采血，用于肌红蛋白检测；取部分股二头肌置于4%中性甲醛液中固定、脱水、包埋、切片、HE染色、普通显微镜下观察，描述组织病理变化；于50 min、150 min由盐水组、姜黄素高浓度组大鼠股二头肌中取1 mm×1 mm×1 mm组织块置于锇酸中固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色、透射电镜观察。

1.5 肌红蛋白检测方法

肌红蛋白检测使用全自动生化分析仪进行测定，具体参数按试剂盒要求设定。

1.6 灰度测量方法

1.7 统计方法

2 结果

2.1 干热环境盐水组、姜黄素高浓度组大鼠骨骼肌组织学观察

盐水组、姜黄素高浓度组0 min时肌纤维染色均匀，部分肌纤维横纹不清晰，肌纤维侧面细胞核排列整齐，核仁清晰，有少量肌纤维部分区域呈灰红色，此区域横纹较为清晰，与周围相比两侧胞核数量较多(图1 A,B)。50 min盐水组肌肉纵切面红肌变淡，部分呈片集中分布，部分散在分布于红肌中(图1C)；姜黄素高浓度组部分红肌局部颜色变淡，且分布较为分散(图1D)。100 min盐水组肌肉纵切面同一根肌纤维中仍保持部分红肌，部分呈现白肌且颜色明显变淡，同一视野下转化白肌的肌纤维数量明显增多(图1E)；姜黄素高浓度组肌肉纵切面同一根肌纤维中局部出现白肌，但颜色仍呈现淡红色，同一视野下转化白肌的肌纤维数量相对较少(图1F)。150 min盐水组肌肉纵切面肌纤维中白肌比例明显增高，只有少部分肌纤维边缘含有红色(图1G)；姜黄素高浓度组肌肉纵切面转化白肌的肌纤维数量有所增多，但颜色仍呈现淡红色(图1H)；150 min盐水组肌肉横切面肌束中多数肌纤维呈现白色，只有肌束边缘少数肌纤维保持红色(图1I)；姜黄素高浓度组肌肉横切面肌束中间部分肌纤维颜色变淡，肌束边缘多为红色肌纤维(图1J)。

图1 干热环境大鼠骨骼肌组织学变化注：A, 0 min盐水组;B, 0 min姜黄素高浓度组;C, 50 min盐水组;D,50 min姜黄素高浓度组;E, 100 min盐水组;F, 100 min姜黄素高浓度组;G, 150 min盐水组;H, 150 min姜黄素高浓度组;I, 150 min盐水组肌肉横切面;J, 150 min姜黄素高浓度组肌肉横切面Fig.1 Histological changes of rats skeletal muscle in dry heat environmentNote:A, 0 min saline group;B, 0 min high dose curcumin pretreatment group;C, 50 min saline group;D, 50 min high dose curcuminpretreatment group;E, 100 min saline group; F, 100 min high dose curcumin pretreatment group; G, 150 min saline group;H, 150 min high dose curcumin pretreatment group; I, 150 min saline group (transverse section of muscle);J, 150 min high dose curcumin pretreatment group(transverse section of muscle)

2.2 干热环境盐水组、姜黄素高浓度组大鼠骨骼肌电镜观察

在干热环境50 min时盐水组骨骼肌肌纤维中部分线粒体浓缩变小甚至消失，线粒体数量明显减少，Z线排列较为整齐；(图2A)姜黄素高浓度组骨骼肌肌纤维中部分线粒体浓缩变小甚至消失，局部线粒体数量有所减少，但在肌纤维边缘部分区域线粒体堆集，有增生迹象(图2B)。在干热环境150 min时盐水组骨骼肌肌纤维中线粒体数量非常少，部分Z线排列不整齐，胞核膜和核仁较为清晰(图2C)；姜黄素高浓度组骨骼肌肌纤维中部分线粒体浓缩变小甚至消失，部分线粒体肿胀模糊，局部线粒体数量有所减少，但在肌纤维部分区域线粒体堆集，有增生迹象，部分Z线排列不整齐(图2D)。以上结果表明干热环境盐水组以线粒体减少为主要组织学改变；姜黄素高浓度组线粒体与盐水组相比减少数量较少，另外无论在干热环境50 min还是150 min均可见线粒体堆集的增生迹象。

图2 干热环境大鼠骨骼肌超微结构变化注：A，50 min盐水组；B，50 min姜黄素高浓度组；C，150 min盐水组；D，150 min姜黄素高浓度组Fig.2 Ultrastructural changes of rats skeletal muscle in dry heat environmentNote: A，50 min saline group; B，50 min high dose curcumin pretreatment group; C，150 min saline group;D，150 min high dose curcumin pretreatment group

2.3 干热环境大鼠血液中肌红蛋白含量的测定

结果显示干热环境大鼠血液中肌红蛋白含量各组比较相差不显著(P>0.05)。说明未出现肌纤维破裂而导致肌红蛋白进入血液中导致血液中浓度增高的现象，表明肌纤维完整性较好。见表1.

表1 干热环境大鼠血液中肌红蛋白(ng/mL)测量结果Table 1 Measurement of myoglobin (ng/mL) in theblood of rats in dry heat environment

2.4 姜黄素对干热环境大鼠骨骼肌白肌含量的影响

盐水组和溶剂组，从0 min到150 min，灰度值逐渐升高，150 min明显高于0 min组(P<0.05)，在各个时间点(0 min除外)，随着姜黄素浓度增加，灰度值均呈下降趋势，在50 min组差异无显著性(P>0.05)，在100 min和150时，姜黄素中、高浓度组灰度值较溶剂组和盐水组差异明显，具有显著性差异(P<0.05)。

表2 干热环境大鼠骨骼肌白肌灰度测量结果Table 2 Measurement of gray scale of rats skeletal musclein dry heat environment

注： 150 min中浓度组、高浓度组与盐水组和溶剂组比较★P<0.05；100 min中浓度组、高浓度组与盐水组和溶剂组比较※P<0.05；盐水组0 min与150 min比较，*P<0.05)；溶剂组0 min与150 min比较，#P<0.05。

Note： At dry heat 150 min, medium and high dose curcumin group compared with saline and solvent group,★P<0.05；At dry heat 100 min, medium and high dose curcumin group compared with saline and solvent group,※P<0.05；In the saline group, Omin group compared with 150 min group *P<0.05; In the solvent group, Omin group compared with 150 min group#P<0.05

3 讨论

骨骼肌是人和动物躯体的重要组成部分，根据骨骼肌肌纤维颜色的不同，将其分为红肌与白肌；而根据骨骼肌肌纤维收缩特性 将其分为慢肌与快肌；在这种分类方法中，红肌实际上对应于慢肌，白肌对应于快肌。根据肌球蛋白 ATP 酶在不同酸碱环境中活性的差异，可将骨骼肌肌纤维分为 I、IIa、IIb 三种类型[2-3]，其中I型对应红色的慢肌；II型对应于白色的快肌。I 型纤维含有丰富的线粒体，表现出氧化代谢功能；II 型纤维含有的线粒体较少，但糖原酵解能力强。骨骼肌肌纤维类型并不是一成不变，它们会在一定条件下发生转变。其中高温应激可诱导Ⅰ型肌纤维向Ⅱ型肌纤维的转化[4-6]。本次研究发现在干热环境中随着时间延长盐水组、溶剂组、低浓度组大鼠骨骼肌红肌减少，白肌增多(P<0.05)，而且白肌肌纤维横纹清晰、结构完整，肌纤维中线粒体明显减少，未发现肌纤维损伤和炎性细胞，同时血液中肌红蛋白含量未见明显变化(P>0.05)，表明本次研究中大鼠骨骼肌红肌减少，白肌增多是一种生理改变的现象，这是高温应激诱导的结果。值得注意的是姜黄素干预组的中浓度组和高浓度组大鼠骨骼肌红肌未见明显减少，白肌未见明显增多(P>0.05)，肌纤维中线粒体数量降低较少，局部有线粒体堆集增生的迹象。表明经过姜黄素预处理后，在高温应激反应中能够抑制Ⅰ型肌纤维向Ⅱ型肌纤维的转化。

近期在肌纤维类型转化研究中发现过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子(peroxisome proliferators-activated receptorγcoactivator 1alpha，PGC-1α)和AIMP1(ARS-interacting multifunctional protein 1, AIMP1)又称 p43 蛋白，均能够促进Ⅰ型肌纤维(红肌)类型属性的形成[7-9]，并且发现PGC-1α和AIMP1在骨骼肌中高度表达，参与了能量代谢、线粒体合成、肌纤维转换等[10-11]。本次研究发现经过姜黄素预处理后，姜黄素高浓度组线粒体与盐水组相比减少数量较少，另外无论在干热环境50 min还是100 min均可见线粒体堆集增生迹象；我们在前期研究中也发现经过姜黄素预处理后的大鼠在干热环境中肝脏、肾脏的线粒体损伤较小，形态较为完整[12-13]；另外在药效研究中已经发现姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，而氧化应激、炎症反应，甚至肿瘤的产生都与细胞线粒体损伤有关。这些研究结果表明姜黄素对细胞线粒体具有一定的保护作用。那么姜黄素是直接作用于细胞线粒体还是间接的通过对PGC-1α和AIMP1之类有利于线粒体保护的因子起作用还需进一步探讨。

综上所述，本研究中姜黄素预处理可以减少干热环境骨骼肌从红肌转向白肌的数量，并对骨骼肌线粒体的减少具有一定的抑制作用，骨骼肌白肌可能是骨骼肌应激状态的代偿状态，伴随无氧酵解能力的增强。但随着应激因素的持续作用最终可能超出代偿能力而发生横纹肌溶解，本组中没有发现骨骼肌溶解，肌红蛋白不高，可能因为干热环境的大鼠处于静止状态，没有附加劳力型运动等应激因素，劳力型热射病常发生在热环境下作业和军事及体育运动者，横纹肌溶解常常是劳力型热射病的过程中导致多脏器功能障碍的重要因素[14]，本研究发现姜黄素能够稳定骨骼肌线粒体数量，阻止骨骼肌代偿的失衡状态。因此我们推测，姜黄素预处理可能在对于干热环境下劳力型热射病并发的横纹肌溶解及继发的多脏器功能障碍具有一定的抑制作用，在临床上具有重大的应用价值，值得进一步探索和研究。