胰腺癌患者临床特征与异种移植模型的相关性*

张 贺 张彩勤 赵 勇 谭邓旭 师长宏

(1.原沈阳军区总医院医务部，沈阳 110015)(2.第四军医大学实验动物中心，西安 710032)

胰腺癌(Pancreatic cancer)是一种恶性程度很高的消化系统肿瘤。临床患者治疗效果十分有限，5年生存率低至6%，约20%的患者有手术机会，术后5年生存率仅为25%[1]。利用免疫缺陷小鼠建立胰腺癌异种移植(patient-derived xenograft，PDX)模型[2]，能够很好地保持肿瘤的遗传特性和异质性，使人们更进一步了解了胰腺癌的生物学特点，而且能够针对不同患者开发个体化治疗方案[3]。然而，胰腺癌PDX影响因素、成模规律及生长特性等机制问题尚不清楚[4]。影响PDX成模的关键因素可能是认知胰腺癌的新视角。本研究通过分析62例胰腺癌患者的临床症状和肿瘤的病理学特征，探索与PDX成模率的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及福利伦理审查

6～7周龄SPF级雄性裸鼠，体质量22～25 g，由常州卡文斯实验动物有限公司 [SCXK(苏)2016-0010] 提供。饲养于第四军医大学实验动物中心SPF级屏障设施 [SYXK(陕)2014-001]。环境温度23～25 ℃，相对湿度40%，12 h昼夜交替，饲料经辐照处理，饮用水经高压灭菌处理，动物自由摄食和饮水。本研究动物实验通过了第四军医大学实验动物福利及伦理委员会批准，编号：14013。

1.2 患者信息及肿瘤病理特征

62例胰腺癌患者来自第四军医大学西京医院(2015年4月至2016年4月)，确诊为胰腺癌，并接受了根治性意向手术。患者信息及肿瘤标本的取得经过患者本人及家属同意，并签署知情同意书，建立患者信息、肿瘤特征及移植瘤模型三者相对应的数据库，供分析研究。人体标本实验通过西京医院医学伦理委员会的批准，批准编号：2015432。

1.3 试剂及药物

基质胶由美国BD公司生产，DMSO购自Sigma公司，胎牛血清由浙江天杭生物科技股份有限公司生产，苏木精和伊红染色液购自北京雷根(Leagene)生物技术有限公司，组织基因组DNA提取试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司生产。

1.4 胰腺癌PDX模型的建立及传代

将患者新鲜的肿瘤组织剪为3 mm3碎块，混合适量的基质胶，利用穿刺针移植到裸鼠背部皮下，命名为P1代；移植瘤生长至1 000 mm3时，异氟烷麻醉小鼠，手术获取肿瘤组织，在另一只裸鼠皮下进行传代，命名为P2代，以此类推，传代至P5代。记录代际间隔时间(从皮下接瘤到移植瘤收获的时间)；冻存各代肿瘤组织(冻存液成分为：10%DMSO+90%胎牛血清)，复苏后观察生长速率。取P5代瘤组织，利用试剂盒提取基因组DNA，送西京医院司法鉴定中心进行STR基因分型检测。

1.5 组织形态学观察

取原发瘤及各代移植瘤组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行HE染色，光学显微镜下观察。

1.6 肿瘤组织CA19-9抗原检测

将制备的组织切片经脱蜡后，弱酸性环境中微波修复抗原，封闭非特异性蛋白并消除内源性过氧化物酶活性，一抗CA19-9(1∶100)孵育过夜；加入二抗(羊抗鼠)，DAB显色后苏木精复染，酒精脱水、甲醛透明并封片；光学显微镜下观察。

1.7 血清CA19-9的检测

各代PDX模型心脏采血，5 000 r/min离心10 min，分离上层血清，送西京医院检验科检测CA19-9含量。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 患者群体临床特征、肿瘤病理特征与PDX模型的相关性

根据肿瘤植入状态评估了实验室接受到的62例患者样本，建立PDX模型，总成模率为47%，见表1和表2。统计分析发现患者人口统计学或临床特征与PDX成模率之间相关性不显著，P>0.05；分析发现，是否接受辅助治疗与PDX成模率相关性不显著，P=0.258；肿瘤转移情况、术后复发情况(术后复发统计数量为去除转移患者数量)和手术类型(根据切除胰腺部位分为Whipple、middle、distal和total 4类)与成模率相关性不显著，P>0.05。患者肿瘤的病理特征分析表明，肿瘤细胞的分化程度和生长位置与PDX成模率之间相关性不显著，P=0.846、P=0.057；胰腺原发瘤的大小与PDX成模率之间存在显著相关性，P=0.041；肿瘤细胞浸润淋巴系统情况与PDX成模率之间相关性极显著，P=0.001。相比之下，肿瘤细胞浸润神经系统并未表明存在显著的相关性，P=0.681。

表1 基于62例胰腺癌患者临床特征和PDX模型相关性统计Table 1 the correlation of clinical features and PDXmodels based on 62 pancreatic cancer patients

注：Whipple：胰十二指肠切除术(pancreatoduodenectomy, PD)；middle：中段胰腺切除(middle segment pancreatectomy)；distal：胰体尾切除术(distal pancreatectomy, DP)；total：全胰切除术(total pancreatectomy, TP)

Note： Whipple：pancreatoduodenectomy; middle：middle segment pancreatectomy; distal：distal pancreatectomy; total：total pancreatectomy

注：组间比较差异性显著，*P<0.05，组间差异性极显著，**P<0.01

Note： comparison among groups significant difference，*P<0.05， comparison among groups extremely significant difference，**P<0.01

2.2 原发瘤与P1至P5代PDX模型移植瘤的一致性

2.2.1STR基因分型检测：STR(short tandemrepeat)基因分型检测所选取的16个位点具有种属特异性，是从人类的23对染色体中所挑选的等位基因，多态性程度高。分析所选取的基因是由2～6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，序列和重复次数决定多态性。在所选取的16个人类基因位点均检测到信号，其人源性判定率为99.99%。

2.2.2肿瘤分化特征对比：HE染色后，对比原发瘤、P1至P5代PDX模型肿瘤分化特征(图1 A)，不同分化程度的原发瘤经过5次传代后，仍然能够保持不同的分化程度。

2.2.3胰腺癌特异性抗原CA19-9免疫组化分析：原发瘤组织和P1代至P5代PDX模型移植瘤组织中胰腺癌特异性抗原CA19-9表达呈阳性，见图1B；两者CA19-9抗原表达无差异。

2.2.4血清中CA19-9的检测结果：血清CA19-9含量是胰腺癌临床诊断的重要指标，临床检测参考值为27 U/mL。患者血清CA19-9值与各代PDX模型血清CA19-9值均高于参考值，提示发生胰腺癌，见图2。

图1 患者与各代PDX模型分化特征(图A)和特异性抗体CA19-9对比(图B)(×20， scale bar=20 μm)Fig.1 Comparison of the differentiation and the specific antibody CA19-9 between patient’stumor (Fig.A) and PDX models (Fig.B)(×20， scale bar=20 μm)

图2 患者与各代PDX模型的血清CA19-9对比Fig.2 Comparison of serum CA19-9 betweenpatients’ and PDX models

3 讨论

人类癌症的复杂性和异质性是建立临床前动物模型不可避免的两个难题。PDX模型能够较好地保持亲本肿瘤中大多数的关键基因和信号通路活性[5-6]，能够更好地模拟患者基因学特征和病理学特征[7]。在胰腺癌研究中，临床前和临床研究的共同障碍是难以获得足够量的肿瘤组织，这一定程度上阻碍了深入研究胰腺癌的致病机理、生长规律及分子特征。Mattie等[8]建立胰腺癌PDX模型，经过多次传代后，原发瘤的基因表达模式在PDX模型中得以维持，同时61%的患者原发瘤样本建立了对应的PDX模型，成功预测了患者不良预后。Jun等[9]利用SCID(severe combined immune deficiency)鼠建立胰腺癌PDX模型，成模率为55.8%。本研究胰腺癌样本量为62例，29例成功建立PDX模型，成模率为47%，略低于上述报道，推测可能与使用的免疫缺陷动物有关，上述研究使用的是免疫缺陷程度更高的SCID鼠，免疫缺陷或许能够提高移植效率[10]。为了有效地利用原发瘤样本，探索PDX模型的影响因素，本研究从患者临床信息和肿瘤病理特征两方面，统计分析了与PDX模型成模率之间的相关性，并验证了原发瘤与5代PDX模型的一致性。

分析结果表明，患者的基本情况，年龄、性别、体质指数和血清CA19-9与成模率无显著相关性；患者的既往病史，如是否患有糖尿病与成模率无显著相关性；虽然，手术外的其他辅助治疗在胰腺癌患者治疗过程中越来越常见[11]，但是与成模率无显著相关性；同样，术式的不同、肿瘤转移情况与成模率也无显著相关性，与报道的胰腺癌PDX模型成模率相关性分析相一致[12]。评估肿瘤病理因素，同一原发瘤可能同时存在不止一种细胞分化状态，造成肿瘤内部的不均一性，这也是肿瘤异质性的一种体现方式，以往观点认为处于低分化程度的肿瘤细胞恶性程度高，对成模率影响较大；但是，本研究的结果表明无论肿瘤细胞处于何种分化程度对成模影响无显著差异；推测不同分化程度的肿瘤细胞对新环境的适应能力才是PDX成模的影响因素。本研究中移植肿瘤的大小与成模率有显著相关性，肿瘤>3.5 cm的成模率显著高于肿瘤<2.8 cm的成模率。术后取得的原发瘤标本形状不规则，无法用体积衡量，一般使用长度单位计量。有报道称，肿瘤大小与异质性程度和肿瘤细胞代谢活性相关[13]，而且，肿瘤>3.5 cm是胰腺癌患者预后的独立影响因素[14]。同时，本研究发现胰腺癌淋巴转移情况与成模率显著相关，表明淋巴转移的肿瘤细胞更具有侵袭性和更高的代谢活性，对新环境的适应能力也更强，利用此类样本建立的PDX模型成模率越高[15-16]。本研究并未统计标本离体时间与成模的相关性，原因是肿瘤标本的采集、运送过程到皮下接瘤全过程用时控制在4 h以内，没有标本离体时间较长的情况发生。

研究报道，PDX模型会随着传代次数的增加，丢失了原发瘤的病理特征，失去了异质性特征[17]。PDX模型经过5～8次传代后，发生突变的几率增大。推测发生突变的原因是肿瘤适应异体生长环境而产生选择性压力导致的，或许由于原发瘤中存在低于可检测范围的亚克隆过度生长所致[18]。如果移植瘤和原发瘤的一致性程度不高，PDX模型就失去了对原发瘤的研究意义，基于PDX模型制定的个体化治疗方案就失去了临床效用。因此，我们对5代PDX模型进行了一致性分析，验证了经过多次传代后的移植瘤和原发瘤的一致性。

综上所述，我们分析了胰腺癌患者的临床特征和肿瘤病理学特征，探索影响PDX成模率的因素，发现原发肿瘤的大小和淋巴转移情况是影响PDX模型成模的重要因素。下一步我们将针对影响肿瘤发生的相关分子进行机制研究，深入了解肿瘤大小及淋巴浸润能力如何影响胰腺癌PDX成模率[19]。同时，扩大样本量覆盖更加广阔的人群，以便研究胰腺癌PDX模型成模的普遍规律。