腺病毒介导BMP-4转染兔SMSCs软骨分化研究*

卫旭东 党 源 温福利 薛来恩 张诗兰 郑和平

(1.蚌埠医学院福总教学医院(解放军福州总医院)骨科研究所，福州 350025) (2.南京军区福州总医院比较医学科，福州 350025)

关节软骨退变或损伤是临床上常见的问题，由于其是无神经、血管的终末分化组织，自身修复十分困难。临床上使用的自体、异体移植或者生物材料均不能从根本上解决软骨缺损的修复问题。新兴的组织工程软骨是目前最具潜力的修复方法，种子细胞、支架材料和诱导因子是修复再生的三大主导因素[1]。这其中最重要、最基本的就是选择一种种子细胞，具有向软骨分化的优势。近年来也发现了多种间充质干细胞具有向软骨分化的潜能，其中滑膜间充质干细胞(Synovial mesenchymal stem cells, SMSCs) 取材方便易分离，和关节软骨属于近亲同源组织，向软骨分化潜能最大[2]，在体外培养较其他间充质干细胞能产生更多的软骨基质，并在多次传代后依旧保持高度成软骨特性[3-4]。其优良的生物学特性，成为再生软骨领域研究的热点[5-6]。

本实验中，使用腺病毒介导BMP-4基因感染兔SMSCs，并嵌入EGFP基因作为报告基因，对转染效率进行评价，摸索合适的转染条件。观察以腺病毒为载体携带的外源性BMP-4基因转入SMSCs所发生的生物学特性及向软骨细胞定向分化能力的变化，为SMSCs在以基因工程为基础的组织工程修复软骨方面的研究、应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

1月龄雄性新西兰兔8只，普通级，体质量(1 000±200)g。由福建省连江玉华山自然生态农业试验场 [SCXK(闽)2014-0001]提供，合格证编号为35002000000082。饲养于解放军福州总医院比较医学科普通环境[SYXK(军)2013-0004]。实验过程中对动物的处置符合相关伦理要求，并按照3R原则给予人道的关怀[7]。

1.2 方法

1.2.1SMSCs的获取与培养:用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg体质量)将新西兰兔麻醉成功后，膝关节脱毛、温水洗净，仰卧位固定。膝关节髌骨旁切口，仔细分离至滑膜组织，将关节囊外包裹的滑膜组织和膝关节韧带一并取出，置于含10 000U/mL青霉素, 10 000 μg/mL链霉素的PBS中，移入超净台，紫外灯照射15 min，PBS冲洗后，将组织剪成1 mm3大小，放入5倍体积的4%Ⅰ型胶原酶，放入37 ℃的恒温培养箱中消化3 h。用200目滤网过滤、收集、清洗细胞后以1200 r/min离心5 min，用含15%FBS的H-DMEM培养基悬浮细胞，按2×105个/cm2的密度接种于培养瓶中，48 h后换液，建立原代培养的细胞，每2 d换液1次。待细胞生长达到85%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2传代。每天以显微镜观察细胞形态和生长状况，传至第2代供实验使用。

1.2.2形态学鉴定:每天通过显微镜观察P1、P2代细胞的生长状态及集落形态。

1.2.3流式细胞仪检测SMSCs表面抗原:将P2代细胞使用0.25%胰蛋白酶消化。取1×105细胞，加入荧光抗体CD44-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC和各抗体相对应的同型对照抗体，室温避光静置20 min。离心去除上清液，流式仪检测计数各项阳性、阴性细胞百分比。

1.2.4重组BMP-4的腺病毒载体系统的构建:重组BMP-4的腺病毒载体系统的构建、扩增和滴度测定，由上海吉玛公司完成。

1.2.5Ad-BMP-4感染SMSCs及其效率分析:取P2代生长旺盛的兔SMSCs消化，细胞计数后以4×105个/mL接种至6孔板中。用含10%FBS的DMEM培养24 h，使用病毒滴度为5×109TU/mL的ADV4-BMP-4的病毒液感染细胞，分组为空白对照组、50、100、200、300、400、500MOI感染组，均以2%FBS浓度的DMEM维持24 h后首次换液，之后每2天换完全培养基培养。转染48 h后使用倒置荧光显微镜观察各组荧光强度，并重悬细胞通过流式细胞仪检测各组绿色荧光标记转染效率。

1.2.6感染后SMSCs生长曲线:将感染不同MOI值的SMSCs按2000个/孔的密度接种于96孔板，每组MOI设置6个复孔，同时设空白对照，放入37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中。在第0、1、3、5、7天加入CCK-8试剂后使用酶标仪检测对应的数据，绘制生长曲线。综合对照明场下细胞生长状态评估最佳MOI。

1.2.7感染后的SMSCs向软骨细胞分化:选取最佳MOI(MOI=300)值后，在后续实验中，设置以下3组，分别为实验组：经最佳MOI值Ad-BMP-4感染的SMSCs，记为Ad-BMP-4(+)；空载体组：经ADV-NC感染，记为Ad-BMP-4(-)；空白对照组：未经病毒感染的SMSCs。

1.2.8感染SMSCs后相关蛋白表达:将3个实验组以培养的第1、3、5、7天为四个时间点收集细胞裂解液，用ELISA检测SMSCs成软骨细胞过程中相关蛋白表达的改变(如BMP-4、SOX9、COLⅡ、AGC的表达)。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 SMSCs鉴定

2.1.1形态学：原代细胞融合至90%大约需要7 d时间，呈滴蜡状(图1 A)。传代后P2代生长迅速，3 d融合至90%，具有典型的成纤维样形态，紧密排列呈梭形，细胞密度增高，融合时呈现漩涡状倾向(图1B)。

2.1.2流式细胞技术检测SMSCs表面标记：取第2代SMSCs经4种流式抗体结合后上机检测，结果显示SMSCs高表达CD44(98.5%)、CD90(96.86%)。而造血干细胞的分子标记物CD34(3.75%)、CD45(2.63%)表达程度非常低(表1)。

表1 SMSCs细胞表面各种标记所占百分比Table 1 SMSCs various cell surfacemarkers as a percentage

图1 SMSCs细胞(×100)注：A：P1代SMSCs细胞;B：P2代SMSCs细胞Fig.1 SMSCs cells (×100)Note: A: P1 generation SMSCs cells,B:P2 generation SMSCs cells

图2 不同MOI值转染P2代SMSCs 48 h在荧光显微镜下的表现(100×)注：A. 50MOI；B. 100MOI；C. 200MOI；D. 300MOI；E. 400MOI；F. 500MOIFig.2 The second generation of SMSCs transfected with different MOI values48 h under fluorescence microscope (×100)Note:A. MOI=50；B. MOI=100；C. MOI=200；D. MOI=300；E. MOI=400；F. MOI=500

图3 空白组和Ad-BMP-4感染P2代SMSCs注：A.空白组(0MOI)；B. MOI=50；C. 100 MOI；D. 200MOI；E. 300MOI；F. 400MOI；G. 500MOIFig.3 Blank group and Ad-BMP-4 infected P2 generation SMSCsNote:A.Blank group；B. MOI=50；C. MOI=100；D. MOI=200；E. MOI=300；F. MOI=400；G. MOI=500

2.2 Ad-BMP-4转染SMSCs效率

Ad-BMP-4按MOI分别为50、100、200、300、400、500转染P2代SMSCs后48 h，在荧光显微镜下即可观察到不同强度的绿色荧光(图2)。随着MOI值增大，表达绿色荧光细胞的百分比增多，荧光强度也随之增强。通过流式细胞仪检测绿色荧光标记百分率分别为54.3%、72.2%、77.8%、85%、86.6%、89.3%(图3，表2)。

表2 流式细胞仪检测ADV4-BMP-4转染SMSCs的效率Table 2 Flow cytometry was used to detect the efficiencyof ADV4-BMP-4 transfected SMSCs

2.3 感染后SMSCs生长曲线

不同MOI值感染SMSCs后，分别在第0、1、3、5、7天加入CCK-8试剂后使用酶标仪检测对应的数据，绘制各组细胞生长曲线(图4)。结合感染效率，当MOI达到300时，继续增大MOI一方面增加标记及表达率效价比不高，另一方面随着MOI增大不可避免地使细胞毒性增加，并对细胞增殖产生负面影响。

图4 使用不同MOI值的ADV-BMP-4感染P2代SMSCsFig.4 Generation 2 SMSCs were transfected withADV-BMP-4 at various MOI values

2.4 ELISA法检测感染后SMSCs相关成软骨蛋白表达

图5 SMSCs相关成软骨蛋白表达情况注：A. BMP4表达水平； B. COLⅡ 表达水平； C. AGC表达水平； D. SOX9表达水平Fig.5 SMSCs-related cartilage protein expressionNote:A. BMP4 expression level；B. COLⅡexpression level；C.AGC expression level；D. SOX9 expression level

Ad-BMP-4(+)、Ad-BMP-4(-)以MOI=300值感染P2代SMSCs，第1、3、5、7天时收集细胞裂解液，ELISA检测BMP-4、SOX9、COLⅡ的表达情况。Ad-BMP-4(+)组与空白对照组、Ad-BMP-4(-)组相比，BMP-4、SOX9、COLⅡ和AGC在蛋白水平的表达均有增高(P<0.05)(图6)。实验结果表明了经ADV-BMP-4感染后的SMSCs能高效表达BMP-4蛋白，并表达软骨细胞特有的Ⅱ型胶原、Aggrecan和SOX9蛋白，说明BMP-4能够促进SMSCs分泌成软骨相关特异性因子，诱导SMSCs向软骨分化。

3 讨论

随着不科学的运动锻炼和人口老龄化加剧等因素使骨关节发病率增高，关节软骨损伤现象在临床上日益多见。脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC)、骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)、脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSC)和滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells，SMSC)是目前组织工程研究中用于修复软骨的种子细胞。SMSCs是一类存在于关节滑膜组织中的多能干细胞。SMSC首次是由De Bari等[8]从人滑膜组织中成功分离，具有多向分化潜能。研究了几种间充质干细胞体内外软骨形成潜能时，发现滑膜来源的SMSC在细胞倍增速率、集落形成和生长动力学优于其他的MSC，修复软骨损伤更具优势[9-11]。滑膜中MSC占比很高，持续扩增10代以上依旧维持相似的生长动力学特征，在同一条件下以SMSCs的成软骨能力最强[12]，Yoshimura和Koga在体内、外实验都得到了同样的结果[10,13]，并且间充质干细胞没有致瘤性[14]。其在软骨损伤修复中具有重要价值。

生长因子在诱导间充质干细胞成软骨分化方面举足轻重。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)，是一类广泛存在，在组织器官发育与胚胎骨骼形成密切相关的蛋白质，是目前发现唯一能单独诱导成骨的蛋白质分子，是诱导游走间质干细胞或骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的必要信号分子[15]。BMP-4在促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化进程中成效显著，通过促进软骨特异性Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成增加新生软骨的各项生化特性[16-17]。近年来基因重组的BMP-2和BMP-7的安全性和有效性得到了充分的证实，2002年7月FDA已批准重组BMP-2用于临床。本实验证实经BMP-4基因转导的SMSCs，使用ELISA试剂盒检测感染后第1、3、5、7天细胞裂解液发现，实验组的BMP-4蛋白表达呈现持续高表达、不断上升态势，与空白组和对照组差异明显。此过程中实验组的成软骨相关基因SOX9、COLⅡ和AGC均高表达，与空白组存在明显差异。天然透明软骨的细胞外基质中主要为胶原和蛋白多糖，胶原中Ⅱ型胶原占据大部分，与众多的蛋白纤维和多糖交织呈网状，维持软骨微环境，是软骨细胞的特征性标志，AGC(aggrecan)蛋白对软骨组织弹性及生物力学抗压性能方面起重要作用，它们的出现是间充质干细胞向软骨细胞分化的一个关键性标志[18]。我们在COLⅡ蛋白表达结果中发现，不仅实验组呈高表达，实验对照组的COLⅡ表达水平自始至终比空白组高，也呈上升趋势；AGC蛋白检测显示空载组在第7天表达量明显高于空白组。具体原因及机制值得我们后续深入研究。

慢病毒和腺病毒是目前相关感染实验中经常使用的基因载体。慢病毒能够感染多种难以感染的细胞，并可以将外源基因插入基因组内实现稳定感染，能长期表达，但存在发生基因重组的隐患。腺病毒不受靶细胞是否为分裂细胞所限感染效率高，基因不会插入基因组中，安全性高、免疫排斥反应低，因而不产生突变或致癌，并且基因表达只能维持一定时期，而后表达逐渐降低直至消失，属于瞬时表达[19]。关于关节软骨损伤使用干细胞修复是一个阶段性的过程，要求在修复期表达足够的生长因子激发干细胞向软骨细胞分化即可，而生长因子的外源性使用存在难以控制浓度，稀释降低效价，而长期高表达的软骨诱导因子不可避免的造成其在受区维持高浓度，通过组织液向临近组织弥散，从而造成不必要的异位骨化及不良反应的发生[20-21]。因而在软骨修复研究中使用腺病毒作为基因载体是较为理想的选择。根据流式细胞仪的检测随着MOI值得不断增大，细胞感染效率得到了提升，为了保证高感染效率的同时能够保证细胞增殖活性，我们对不同MOI值做了增值曲线，发现当MOI大于300后细胞增殖率明显降低，感染效率提升效价比低，明场下观察细胞，死亡数量明显增多，活力明显下降。本实验中选取MOI=300作为感染量是合适的，并且感染了外源性BMP-4启动并促进了SMSCs的软骨分化，实现了间充质干细胞作为组织细胞修复基石的同时，自身携带目的基因实现基因治疗，为组织工程软骨修复提供了更加优秀的“种子细胞—生长因子”整合构建方法，避免了外源性生长因子的多次反复注射，也符合当前骨科治疗的“微创”原则。