TNIP1基因rs7708392多态性与动脉粥样硬化相关性研究

于建忠

脑卒中是一种严重危害国内外中老年人的常见病，它具有发病率高、死亡率高、致残率高和复发率高等特点，既往发病机制的研究表明，脑卒中与遗传因素密切相关，而动脉粥样硬化又是脑卒中最常见的原因之一。TNFα诱导蛋白3相互作用蛋白1（TNFα -induced protein 3-interacting protein 1，TNIP1），又称为A20结合核因子κB抑制蛋白1（ABIN1），可与多种受体结合，如肿瘤坏死因子（TNFα）、上皮生长因子（EGFR）、TOLL样受体、过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）等，是一种炎症调节因子，而炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展中起着决定性作用，类风湿关节炎和系统性红斑狼疮的患者中，这种炎症反应尤其明显，并且可能导致该类患者的心血管疾病死亡率增高[1-2]，因此，TNIP1可能通过参与炎症反应而导致动脉粥样硬化的发生发展。本研究拟探讨TNIP1基因rs7708392多态性与动脉粥样硬化发生风险的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 包括脑卒中高危人群和健康体检人群，依据国家卫生部《2013年脑卒中高危人群筛查和干预项目技术方案》的参考标准，自2014年5月—2017年8月，以海南省内的乡镇社区常住人口作为脑卒中高危人群的筛查对象，选定海南省文昌市及海口市得胜沙社区作为筛查地区，所有入组人群均为汉族人，年龄≥40岁常住人口作为筛查对象，根据脑卒中高危人群筛查和干预工作流程，依据以下危险因素进行风险评估：（1）高血压病史（≥140/90mmHg）或正在服用降压药；（2）房颤或明显的脉搏不齐；（3）吸烟；（4）血脂异常或未知；（5）糖尿病；（6）日常很少的体育运动（体育锻炼的参照准则是每周锻炼大于3次、每次大于30分钟、持续时间不少于1年；从事中重度体力劳动者视为经常有体育锻炼）；（7）明显超重或肥胖（BMI≥26kg/㎡）。凡符合以上任意3条，则判定为脑卒中的高危人群。

经医院伦理委员会同意自2014年9月—2017年8月期间，在湘雅附属海口医院体检中心内科诊室收集健康人群的样本，采集参与者周围静脉血，同时，询问病史，收集相关的指标，包括年龄、性别、血压、吸烟饮酒情况、家族史等。

入组标准：（1）入组者必须为本地籍贯且长期居住汉族人，相互之间无血缘关系；（2）自愿入组者经现场咨询同意后签订知情同意书，并符合入组及排除标准的体健者判定为健康组研究人群；（3）所有入组者必须具备颈部血管B超检查。

排除标准：（1）外地籍贯及本省籍贯但不在此居住者；（2）既往无心脑血管病病史；（3）无严重的心肝肾疾病史；（4）无全身免疫系统疾病，如系统性血管炎、系统性红斑狼疮、结缔组织病史；（5）无心脏病史，如冠心病、心力衰竭等；（6）无癌症病史。

根据颈部血管彩超检查有无动脉粥样硬化分为病例组和对照组。检查提示具有内膜增厚、血管斑块或血管狭窄者归入病例组；颈部动脉血管无动脉粥样硬化表现为对照组。

对所有符合条件的入组者，在入组的当天或次日清晨空腹状况下，采集3～5ml周围静脉血，放置在EDTA抗凝试管中，置于-20℃冰箱中暂时储存，分批次集中提取样本DNA，以备后期进一步研究。

1.2 主要试剂和仪器 GoldMag-Mini全向基因DNA纯化试剂盒（117883）和Sequenom公司iPLEX Gold试验技术，试剂包括：进口纯净水、PCR Buffer（10×）、MgCl2（25mM）、iPLEX Buffer（10×）、dNTP mix（25mM）、iPLEX 酶、Hotstar Taq（5U/μL）、Termination mix、SAP 酶 （1.7U/μL）、SAP Buffer（10×）、SpectroCLEAN 树 脂 。GeneAmpPCR System9700 PCR仪、NanoDrop2000分光光度仪、MassARRAY质谱仪。

1.3 方 法

图1 rs7708392位点的基因分型图

1.3.1 DNA提取 使用西安金磁纳米生物技术有限公司生产的GoldMag-Mini全血基因组DNA纯化试剂盒（批号117885）进行样本DNA的提取纯化，严格按照厂家说明书进行操作提取全血DNA。并对所得到的DNA采用NanoDrop2000分光光度计测定其浓度及纯度。只有DNA浓度和纯度都在允许范围内的样品，才可作为合格样品用于下一步的实验。

1.3.2 引物设计与合成 引物设计主要是使用Sequennom MassARRAY Assay Design 3.0 software软件，通过该软件对所选位点进行引物及单碱基延伸引物的设计。rs7708392的引物位点如下：1st-PCR引物：ACGTTGGATGAGGCCAACTGGTCAATTCTC；2nd-PCR引物：ACGTTGGATGGGGTCTCTTCTGGAACTT AG；UEP 序列：ggggaTGGAACTTAGTAGACTAGTCA

1.3.3 基因分型 本实验采用Sequennom MassARRAY分子量阵列技术对所选择的位点进行分型，即将 MassARRAY iPLEx（sequelloin，SanDiego，CA）的分型平台与时间飞行质谱生物芯片系统（MassARRAY sequenom SNP）相结合的方法。分型步骤：PCR扩增反应以延伸基因位点两端的序列；SAP酶处理以降解扩增用的dNTP；延伸引物进行单碱基延伸反应；树脂除盐纯化；上机点样；MassARRAY Analyzer Compact质谱检测，根据质谱峰的位置确定分子质量，进行基因分型（图1）。基因位点分型依据：第一条红色虚线为UEP的分子量，第二条红/蓝色虚线为UEP+G碱基的分子量，第三条红/蓝色虚线为UEP+C的分子量。若第三条线处出峰，则为CC型纯合子。若第二条线处出峰，则为GG型纯合子。两条线处均出峰，则为GC杂合子。

1.4 统计学方法 应用SNPStats在线软件（https://www.snpstats.net）进行数据分析。（1）研究对象的一般资料分析：计量资料采用T检验，计数资料采用χ2检验；（2）哈迪-温伯格平衡检验：计算对照组中基因位点的基因型及等位基因频数，并认为对照组中最小的等位基因频率作为风险等位基因。然后，采用卡方检验对对照组内基因位点的平衡性进行检验，若P＞0.05，则说明满足哈迪-温伯格平衡，相反，若P＜0.05，则表明所选取的样本未达到随机平衡状态，不具有群体代表性。（3）疾病风险的关联分析：测定基因型与疾病风险之间的关系[4]。

2 结果

2.1 临床资料比较 本研究共纳入病例组264例，其中男性 110例，女性 154例，年龄（65.15±10.87）岁，对照组320例，其中男性148例，女性172例，年龄（65.69±10.77）岁，两组之间在年龄、性别、吸烟史、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TCHO）、低密度脂蛋白（LDL）的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。病例组高密度脂蛋白（HDL）高于对照组（P＜0.01）。见表 1。

2.2 哈迪-温伯格平衡检验 该位点在两组中的基因型频率符合哈迪-温伯格平衡检验（P＞0.05）。两组人群最小等位基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 基因模型比较 在矫正年龄、性别的情况下，计算各个模型下的优势比（OR）和95%的可信区间（95%CI）。两组间所有基因模型下差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 2。

在男性亚组中，rs7708392在显性模型、加性模型及杂合子情况下增加动脉粥样硬化的发病风险（P＜0.05）；而在女性亚组中，该变异在任何模型下差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 3、4。

3 讨论

目前，TNIP1基因变异与脑血管病风险相关性的研究鲜有报道，我们的前期研究发现，TNIP1基因rs7708392位点可能增加动脉粥样硬化性脑梗死的发病风险[5]。那么，rs7708392与动脉的粥样硬化之间是否具有相关性，本研究发现在整体分析中该变异在等位基因以及五种遗传模型下与动脉粥样硬化的风险无统计学意义。在亚组分析时，男性亚组人群中，该位点在显性、加性及杂合子模型下增高动脉粥样硬化的发病风险（P＜0.05）。

表1 病例组与对照组临床资料比较（%±s）

表1 病例组与对照组临床资料比较（%±s）

注：TG：甘油三酯；TCHO：胆固醇；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白

组别对照组病例组P值例数320 264年龄（岁）65.69±10.77 65.15±10.87 0.55性别（女）[例（%）]172（53.75）154（58.33）0.27吸烟[例（%）]45（14.06）29（10.98）0.27 TG（mmol/L）2.13±1.34 2.01±1.21 0.26 TCHO（mmol/L）5.69±1.04 5.73±1.14 0.71 HDL（mg/dL）1.36±0.36 1.54±0.50＜0.01 LDL（mg/dL）3.68±0.90 3.74±0.88 0.37

表2 rs7708392多态性与动脉粥样硬化风险相关性

表3 男性亚组rs7708392多态性与动脉粥样硬化风险相关性

表4 女性亚组rs7708392多态性与动脉粥样硬化风险的相关性

TNIP1基因位于人染色体5q32～q33.1，其中外显子18个，该基因所编码的A20结合核因子κB抑制蛋白1（ABIN1），ABIN1与其配体A20蛋白结合并相互作用，可以下调NF-κB病理通路的活性[6]。TNIP1基因过表达还可以通过抑制肿瘤坏死因子α（TNFα）而抑制 NF-κB 的活性[7]。TNIP1 基因多态性可能通过影响基因表达或功能引起NF-κB病理通路异常，从而诱导炎症相关疾病的发生。亦有动物模型研究[8]发现小鼠模型血管内皮功能失衡和心肌的肥厚，ABIN1参与慢性炎症与心血管疾病的发生。所以，TNIP1在炎症、血管内皮细胞功能、心脑血管病的发生等方面起着重要作用。

目前，关于TNIP1基因变异的研究，主要集中在自身免疫性疾病如银屑病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎的人群中，并且该基因的突变可增加系统性红斑狼疮的患病风险[9-10]。rs7708392研究也以系统性红斑狼疮为主，虽然该变异位点存在遗传异质性，有种族或地域的差异性，欧洲人群G等位基因频率（约70%）显著高于亚洲人群（约30%），但是，多项研究[11-13]证实该位点确实增加中国汉族、欧洲及日本人群红斑狼疮的风险。一项纳入12篇研究的Meta分析[14]提示该位点增高红斑狼疮的发病风险，但是，他们的研究结论显示C等位基因频率增高发病风险。本研究显示，虽然该变异在总体分析时两组间未见显著性差异，但在男性亚组分析时发现GC基因型、加性模型和显性模型都可能与动脉粥样硬化的风险相关。由此可见，该基因变异在红斑狼疮和动脉粥样硬化或动脉粥样硬化性脑梗死中发挥着重要作用，但是，具体的致病机制有待进一步研究。

本研究存在一些不足：（1）本次研究中，动脉粥样硬化的界定主要依据颈部血管彩超检查，部分病例可能有其他部位的动脉粥样硬化，从而造成分组的错误；（2）由于样本量有限，尤其是在亚组分析时，因此有待进一步增加样本量进行验证；（3）由于仅仅对单个位点进行关联分析研究，基因-基因交互作用研究仍有待进一步开展。（所有数据由本人在中南大学湘雅医学院读博期间于附属海口医院采集完成。）