解毒化浊方诱导HER-2阳性乳腺癌SK-BR-3细胞凋亡的研究

谷焕鹏 胡升芳

乳腺癌是高度异质性的恶性肿瘤，HER-2阳性乳腺癌，恶性程度高、生存率低、病情进展迅速、易发生转移、预后差[1]。HER-2阳性乳腺癌西医治疗以单克隆抗体曲妥珠单抗为主，其显著降低HER-2阳性乳腺癌死亡率[2]，将疾病无进展生存期延长12.6周[3]，但25%患者出现心脏毒性[4]。“解毒化浊方”是本课题组总结多年临床经验方，用于治疗HER-2阳性乳腺癌，取得较好的疗效，具备一定的理论和临床疗效基础[5-6]。本实验通过“解毒化浊方”中药干预乳腺癌细胞，探讨中药诱导乳腺癌细胞凋亡的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物及细胞株 雌性Wistar大鼠，SPF级,体质量200±20g，购自浙江中医药大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002。人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞（中国科学院上海细胞研究所编号TCHu225）。

1.2 药物及试剂 “解毒化浊方”由蛇六谷、怀牛膝、半枝莲各30g，黄芪15g，白术 9g，茯苓12g组成。以上中药饮片均由浙江中医药大学附属医院中药房提供（批号151102），按传统煎煮方法制成中药水煎剂，浓缩为3.2g/mL（含生药量）。HER-2抑制剂Mubritinib（TAK-165）（MCE 公司，批号 15426）；DMEM 培养基（美国Gibco公司，批号1801040206）；胎牛血清（美国 Gibco 公司，批号 10099141）；Annexin V/PI（美国BD 公司，批号 6301518）。

1.3 仪 器 流式细胞仪（FC500），美国BECKMAN公司；CO2培养箱（3111），美国 THERMO FISHER；荧光倒置显微镜（IX70-S8F），日本奥林帕斯公司，日本三洋电器有限公司；超净工作台（SW-CJ-1FD），苏州安泰空气技术有限公司。

2 实验方法

2.1 动物分组及剂量设置 将8只雌性Wistar大鼠随机分为对照组、中药组（解毒化浊方组）、西药组（HER-2抑制剂组）、联合组（解毒化浊方+HER-2抑制剂组），每组2只。按“实验动物与人的体表面积比”中人鼠等效药量换算方法计算给药剂量，中药给药剂量18.8g/（kg·d）（均为生药量）。中药组大鼠给予解毒化浊方水煎剂灌胃，每天2次，每次3mL/只；对照组大鼠等量生理盐水灌胃，每天2次，每次3mL/只；西药组大鼠给予HER-2抑制剂Mubritinib（灌胃），每天2次，每次2mg/只；联合组大鼠给予解毒化浊方水煎剂灌胃每次3mL/只，Mubritinib每次2mg/只，每天2次。

2.2 动物采血及含药血清制备 给药连续3天后，当夜禁食不禁水，第4天给药1次，各给药组在末次给药后1h腹主动脉采血，将血液注入无菌试管，加盖。无菌分离血清，离心，3000r/min，5min。同组混合以消除个体差异，用0.22μm的滤膜过滤，56℃，30min水浴灭活，-20℃保存备用。

2.3 SK-BR-3细胞培养、细胞接种及给药方法人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞用DMEM培养液培养，加入15%胎牛血清、1%青霉素与链霉素，37℃，5%CO2及饱和湿度培养。5d传代1次，将对数生长期的细胞以培养液调成1×105/mL，接种于6孔培养板上，200μL/孔，每组3孔，加入占培养基终浓度20%的含药血清，按实验设计分组为对照组、中药组、西药组、联合组,分别加药处理，在常规条件下培养，分别干预细胞24h和48h后流式仪检测。

2.4 AnnexinV-FITC/PI法流式检测细胞凋亡 将含药血清作用SK-BR-3细胞后，用胰蛋白酶消化,并用磷酸盐缓冲液洗涤,将待测细胞数调整为5×105/mL，离心15min，弃上清液，PBS洗涤，将细胞重悬于binding buffer 300μL，加入 Annexin V-FITC 10μL，轻轻摇匀，室温反应1h，加入PI 5μL，轻轻摇匀，室温反应放置15min，在流式细胞仪上进行检测，分析细胞凋亡率。

2.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 解毒化浊方给药血清作用24h对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞凋亡的影响 中药组与对照组比较早期、晚期凋亡率、总凋亡率增加，差异无统计学意义（P＞0.05）；西药组、联合组与对照组比较早期凋亡率、总凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组之间晚期凋亡率差异不明显（P＞0.05）。见表 1、见图 1（封四）。

3.2 解毒化浊方含药血清作用48h对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞凋亡的影响 与对照组比较，各用药组早期凋亡率明显增加（P＜0.05）；与对照组比较，西药组、联合组细胞凋亡率、总凋亡率明显增加（P＜0.05）；中药组与对照组比较晚期凋亡率、总凋亡率增加，差异无统计学意义（P＞0.05）；西药组与联合组比较早、晚期凋亡率、总凋亡率变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。干预细胞48h与24h后比较，西药组、联合组较中药组晚期细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）。见表 2、见图 2（封四）。

表1 解毒化浊方含药血清作用24h对人乳腺癌细胞SKBR-3细胞凋亡的影响（%，±s）

表1 解毒化浊方含药血清作用24h对人乳腺癌细胞SKBR-3细胞凋亡的影响（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组中药组西药组联合组孔数3333早期凋亡率1.03±0.23 2.43±0.33 4.76±0.63*6.93±0.76*晚期凋亡率1.50±0.34 2.33±1.09 2.23±1.13 2.23±1.13总凋亡率2.53±0.42 4.76±1.41 7.00±1.75*9.93±0.28*

表2 解毒化浊方含药血清作用48h对人乳腺癌细胞SKBR-3细胞凋亡的影响（%，±s）

表2 解毒化浊方含药血清作用48h对人乳腺癌细胞SKBR-3细胞凋亡的影响（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组中药组西药组联合组孔数3333早期凋亡率1.60±0.10 4.76±0.23*8.56±0.64*6.80±0.10*晚期凋亡率1.93±0.20 4.40±0.32 32.90±2.00*22.86±9.74*总凋亡率3.53±0.13 9.16±0.21 41.46±1.93*34.83±6.51*

4 讨论

元·朱丹溪《丹溪心法·赤白浊》认为，“浊主湿热、有痰、有虚”，故治浊当补虚清化，方从法立，根据健脾除湿化浊法，结合临床体质调查和症药数据挖掘，从本课题组前期已完成乳腺癌术后诊疗规律研究挖掘数据，选出最能体现疗效的用药频次最高的六味药组成的聚类方“解毒化浊方”。方中出现频次，怀牛膝（1116次）、蛇六谷（1073次）、半枝莲（1041次），黄芪（1082次）、白术（1179次）、茯苓（1179次）。解毒化浊方中的六味药从邪之初、已成、热结等三个层面，通过表托、内利两条途径化解浊毒[7]，解毒化浊方尤其适用HER-2阳性乳腺癌术后的治疗。

本课题组根据HER-2阳性乳腺癌脾虚浊毒易生的病机特点，在观察临床乳腺癌高危人群血浆凋亡相关基因产物变化的基础上[8]，进一步开展了中药调控乳腺癌细胞HER-2过表达后对PI3K/Akt通路的影响，研究[9]结果发现，乳癌术后方血清干预人乳腺癌细胞株MDA-MB-453细胞，用药各组p-Akt蛋白表达含量均较对照组明显降低，表明用药组能够通过抑制Akt蛋白的磷酸化水平发挥抗乳腺癌的作用。药物干预细胞后，可以通过调控HER-2受体家族及其下游信号PI3K/Akt转导通路以及改变调亡相关蛋白。前期研究发现解毒化浊方具有抑瘤作用，其作用机制有待于进一步探讨。

细胞凋亡是程序性的细胞死亡，能否诱导肿瘤细胞凋亡成为当今药物治疗肿瘤效果的判定标准之一[10]。本实验结果发现，解毒化浊方中药血清干预SK-BR-3细胞24h后，各用药组与对照组比较早期细胞凋亡率、总凋亡率明显增加，西药组、联合组尤其明显（P＜0.05），表明中药具有协同抑制剂增效的作用。干预SK-BR-3细胞48h后，各用药组与对照组比较早期细胞凋亡率明显增加，表明中药具有促进细胞凋亡作用。干预细胞48h与24h后比较，西药组、联合组较中药组晚期细胞凋亡率明显增加，联合组较单纯抑制剂组晚期细胞凋亡率有所减少，表明联合组具有降低抑制剂的毒性同样发挥诱导细胞凋亡的作用。

综上所述，解毒化浊方可能有诱导乳腺癌SKBR-3细胞凋亡，协同抑制剂减毒增效的发挥抑瘤作用。