不同盐碱胁迫对土壤细菌群落结构的影响

张慧敏，郭慧娟，侯振安

(石河子大学农学院资环系/新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】土壤中水溶性盐分离子积累会导致土壤盐化，而Na+含量过高会造成土壤结构破坏、pH值升高，导致土壤碱化[1]。【前人研究进展】土壤盐化与碱化是两种不同的非生物胁迫类型[2]。土壤的盐分含量高会增加土壤渗透势，降低水分和养分有效性，抑制植物生理代谢过程，导致植物生长受阻、生产力下降[3]。盐碱胁迫对植物的危害程度从大到小依次是盐碱胁迫 > 碱胁迫 > 盐胁迫[4,5]。由于农业管理措施如灌溉、施用化肥等易导致土壤盐碱化，因此，盐碱胁迫对于农业土壤尤为重要[1]。农业生产活动导致的土壤盐碱化不仅影响土壤的理化特性, 而且对土壤微生物和生物化学性质也有很大影响[6]。土壤微生物群落在土壤有机质分解、养分循环和保持植物生产力等方面发挥着根本性作用[7]。因此，了解微生物对环境胁迫的响应非常重要。国内外针对自然盐渍土壤的微生物群落已经开展大量研究，多数研究认为盐分胁迫对土壤微生物群落及其活性具有不利的影响，抑制微生物生长、微生物生物量减少、土壤呼吸和酶活性降低[8-11]。Wong等[12]研究发现土壤呼吸速率低盐度处理最高，中等盐度处理最低；而土壤微生物生物量高盐度处理最高，低盐度处理最低。盐胁迫对土壤呼吸速率和微生物生物量的影响比碱胁迫更为明显。盐碱胁迫对土壤呼吸速率和微生物生物量的影响趋势不一致，可能是由于土壤微生物群落组成发生了改变。有研究表明，NaCl胁迫显著影响滨梅根际和非根际土壤细菌群落多样性，盐处理非根际土壤细菌群落的Shannon-Wiener指数和丰富度指数下降[13]。【本研究切入点】细菌是土壤微生物中最主要和最活跃的类群，直接参与土壤中物质和能量的转化与循环，土壤细菌群落组成结构及其多样性在一定程度上能够反映土壤质量。土壤盐化和碱化对植物生长和土壤质量都会产生严重的负面影响，但与植物盐胁迫研究相比，盐碱胁迫对土壤微生物群落影响的研究还比较少[14]。【拟解决的关键问题】通过盆栽模拟试验，应用高通量测序技术，研究NaCl、Na2SO4和NaHCO3+Na2CO3三种盐碱胁迫土壤细菌群落的变化，分析不同盐碱胁迫对土壤细菌群落多样性和结构的影响，为盐碱土的改良利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验于2016年在石河子大学农学院试验站温室进行。供试土壤采自试验站农田，土壤类型为灌耕灰漠土，质地为壤土，含盐量0.53 g/kg；pH 8.16；有机质6.77 g/kg；全氮0.57 g/kg；有效磷7.21 mg/kg；速效钾182 mg/kg。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

通过向供试土壤中分别添加NaCl、Na2SO4、Na2CO3+NaHCO3三种盐分设置不同盐碱类型和盐碱度。依据全国第二次土壤普查规定的盐渍土盐碱类型划分、盐渍土分级标准和苏打碱化盐渍土分级标准[15]，试验设置氯化物、硫酸盐和苏打碱化3种土壤盐碱类型，每种盐碱类型下设置：非盐(碱)化、轻度和中度盐(碱)化3个等级。每个处理设6个重复。表1

表1 不同处理土壤盐碱类型及盐碱化程度

Table 1 Type and degree of saline and alkaline in soil under different treatments

处理Treatment盐碱类型及盐碱化程度Saline and alkaline含盐量Salt content(g/kg)电导率EC1∶5(dS/m)pH(1∶2.5)CK对照-非盐(碱)化0.530.178.16C1NaCl-轻度盐化2.430.768.36C2NaCl-中度盐化4.431.398.43S1Na2SO4-轻度盐化3.431.078.34S2Na2SO4-中度盐化6.432.018.19A1Na2CO3+NaHCO3-轻度碱化1.130.368.97A2Na2CO3+NaHCO3-中度碱化2.030.639.92

供试土壤自然风干，碾碎后过2 mm筛。将NaCl、Na2SO4、Na2CO3+NaHCO3(重量比1∶1)分别配制成盐溶液，然后将盐溶液加入供试土壤至过饱和状态(对照加同体积的去离子水)，放置1个月使土壤达到平衡。将处理土壤自然风干，碾碎后过2 mm筛，取样测定土壤含水量、盐分含量、pH值等。

试验使用直径20 cm，高60 cm的土柱。将处理后的土壤按照容重1.25 g/cm3分层装土50 cm，每10 cm一层，每个土柱装土20 kg。灌溉方式为滴灌，滴头流量2.1 L/h，滴头间距40 cm。滴灌管带平铺在土柱上，每个土柱由1个滴头供水，滴头固定在土柱顶部中心位置。棉花于2016年5月6日播种，每个土柱播种20粒。为保证棉花出苗，播种后每个土柱滴出苗水3 L。棉苗长出2片真叶时定苗，每个土柱保留4株长势均匀的棉苗。试验期间定期称重补水，使土壤含水量保持在田间持水量的60%～80%。播种后80 d(棉花开花期)试验结束。

1.2.2 样品采集

采集0～30 cm土壤样品，一部分新鲜土壤样品置入冰盒中，立即带回实验室置于-80℃冰箱中储存，用于土壤细菌群落多样性的测定。另外一部分土壤样品自然风干后，用于土壤含水量、盐分含量、pH值的测定。土壤含水量测定采用烘干法，土壤水溶性盐总量采用烘干残渣法和电导法(EC1∶5，土水比1∶5土壤浸出液电导率)，土壤pH采取pH计法(土水比1∶2.5)。

1.2.3 土壤细菌群落多样性1.2.3.1 DNA提取和PCR扩增

采用 CTAB-SDS方法对土样DNA进行提取，将提取的用琼脂凝胶电泳检测合格的DNA稀释。使用16S rRNA 基因V4区(515F-806R)(5′-3′)：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，GGACTACHVGGGTWTCTAAT为测序引物，对稀释后的DNA进行PCR扩增。

1.2.3.2 PCR产物处理、文库构建和上机测序

检测PCR产物，回收产物。对文库进行构建，经检测合格后，通过HiSeq 2500 PE250(Illumina 公司，美国)进行高通量测序(康普森生物技术有限公司，北京)。

1.3 数据处理

对上机得到的Tags序列与数据库(Unite database)进行比对检测[16]，得到最终的有效数据。利用Uparse[17]软件对得到的 Effective Tags以97%的一致性(Identity)进行聚类，对得到的OTUs(Operational Taxonomic Units)序列进行物种注释[18-19]，并在各个分类水平统计各样本的群落组成。根据所有样品在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35的属，根据其在每个样品中的丰度信息，从物种和样品两个层面进行聚类，绘制成热图，便于发现哪些物种在哪些样品中聚集较多或含量较低。使用MUSCLE[20]软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。数据均一化处理后，根据OTUs聚类分析结果和研究需求，分析不同样品(组)之间共有、特有的OTUs，当样本(组)数小于5时，绘制成韦恩图(Venn Graph)。对均一化处理的数据进行细菌群落多样性分析(α-多样性和β-多样性)。α-多样性使用Qiime软件(Version 1.7.0)计算细菌群落结构的多样性指数(Shannon、Simpson指数)和丰富度指数(Chao1、Ace指数)；β-多样性采用R软件(Version 3.4.3)的vegan 程序包(Version 2.4-5)进行非度量多维尺度分析(NMDS， Nonmetric Multidimensional Scaling)。采用SPSS 17.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)方差分析，处理间的多重比较采用Duncan法(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫对土壤细菌群落α-多样性影响

土壤细菌群落16S rRNA高通量测序共获得442 798个有效序列，各样品平均序列数为63 257条(51 978～69 353)。在97%的相似度下，各处理样品文库的覆盖度均高于0.977。表明所测序列能够较好地反映细菌群落的种类和结构。表2

不同处理土壤样品的OTUs 数在3 050～4 005，平均为3 532(表2)。其中，NaCl胁迫处理(C1、C2)OTUs数目与对照(CK)无显著差异；Na2SO4胁迫(S1、S2)和Na2CO3+NaHCO3碱胁迫(A1、A2)处理的OTUs数目显著低于CK。从不同处理土壤OTUs的相互关系来看，三种盐碱胁迫处理与对照所共有的OTUs占69.65%～80.25%(图1)。C1、C2处理土壤细菌群落的OTUs在CK中没有出现的比例为23.30%、30.35%，具有特异OTUs为427～455、748～767个。S1、S2处理的OTUs在CK中没有出现比例为23.51%、19.75%，具有特异OTUs为324～390、217～292个。A1、A2处理OTUs在CK中没有出现比例为21.13%、20.24%，具有特异OTUs为206～211、183～195个。在有NaCl胁迫处理相比情况下，CK处理的特异OTUs为419～500个；而与Na2SO4和Na2CO3+NaHCO3碱胁迫处理相比，CK处理的特异OTUs为871个。说明不同盐碱类型和盐碱度胁迫处理土壤的细菌群落多样性发生了明显改变。表2，图1

各处理土壤细菌群落Shannon、Simpson指数差异均不显著(P>0.05)。

C1处理土壤细菌群落Chao1和Ace指数最高，但与CK、C2差异未达到显著性水平。S1、S2土壤细菌群落Chao1和Ace丰富度指数显著降低，分别比CK低20.06%～25.51%和17.76%～24.66%。碱胁迫A1、A2处理Chao1和Ace丰富度指数显著也显著低于CK。总体上，不同盐碱胁迫对土壤细菌群落多样性指数无显著影响；Na2SO4胁迫和Na2CO3+NaHCO3碱胁迫处理土壤细菌群落丰富度指数显著降低。表2

表2 土壤细菌群落多样性和丰富度指数

Table 2 Soil bacterial community richness and diversity index

处理Treatment序列数Sequence numberOTUs 数目OTUs number覆盖度CoverageShannon指数Shannon indexSimpson指数Simpson indexChao1指数Chao1 indexAce指数Ace indexCK69 353a3 996a0.980a9.601a0.991a4 236a4 257aC169 230a4 005a0.978a9.851a0.997a4 671a4 695aC262 405ab3 879a0.980a9.707a0.995a4 288a4 280aS156 778ab3 176b0.977a8.814a0.980a3 226b3 287bS266 664a3 355b0.978a9.206a0.993a3 462b3 588bA151 978b3 050b0.979a9.139a0.993a3 446b3 529bA266 390a3 264b0.981a9.157a0.993a3 504b3 500b

注：同一列不同小写字母表示处理间差异达到显著水平(P< 0.05)

Note：Different lowercase letters within the same column indicate significant difference (P< 0.05)

图1 土壤细菌群落OTUs维恩图

Fig.1 Venn diagram of the OTUs of the soil bacterial communities

2.2 盐碱胁迫对土壤细菌群落β-多样性影响

进行非度量多维尺度(NMDS)和聚类分析表明，NaCl轻度盐化处理(C1)土壤细菌群落结构与对照(CK)差异不明显，其它盐碱胁迫处理土壤细菌群落结构均与CK有明显差异(图2a)。聚类分析也表明，NaCl中度盐化处理(C2)土壤细菌群落结构明显区别于其它处理，Na2SO4轻度盐化处理(S1)和中度盐化处理(S2)之间差异明显，而两个Na2CO3+NaHCO3碱胁迫A1、A2处理间土壤细菌群落结构相似，且与S1处理也有一定的相似性(图2b)。图2

图2 土壤细菌群落的非度量多维尺度分析NMDS(a)和 UPGMA聚类分析(b)

Fig.2 The analysis of NMDS (a) and UPGMA cluster (b) in soil bacteria community

2.3 盐碱胁迫对细菌群落门水平的影响

将得到的序列与数据库进行比对，99.2%～99.7%的序列分类到不同的细菌门类，0.3%～0.8%的序列分类到古菌门类。不同处理土壤细菌优势门类为：变形菌门(Proteobacteria)(36.31%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(14.88%)、放线菌门(Actinobacteria)(11.93%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(11.19 %)和拟杆菌门(Bacteroidetes)(9.36 %)，其相对丰度均大于5%，平均占总序列的83.67%(74.77%～88.60%)。其次是疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝藻门(Cyanobacteria)，平均相对丰度均大于1%。其余细菌门类的相对丰度都小于0.5%(包括热微菌门(Thermomicrobia)0.45%，其它门类合计2.84%)。表3

表3 土壤主要细菌门类的相对丰度(%)

Table 3 The relative abundance (%) of dominant bacterial phylum in soil

分类Taxonomy处理 TreatmentCKC1C2S1S2A1A2细菌 Bacteria变形菌门 Proteobacteria41.79a35.81a36.49a33.45a37.27a41.60a27.77 a芽单胞菌门 Gemmatimonadetes14.44a15.53a14.91a13.43a18.95a12.28a14.58a放线菌门 Actinobacteria17.07a10.39bc10.47bc8.95c14.58ab10.23bc11.83bc酸杆菌门 Acidobacteria9.55c14.18ab8.93c13.45b7.647c9.54c15.06a拟杆菌门 Bacteroidetes5.75c7.92bc9.88ab5.49c9.26ab13.31a13.92a疣微菌门 Verrucomicrobia2.47c2.94bc2.82bc3.17b2.52c3.65ab4.34a浮霉菌门 Planctomycetes1.49c2.61b3.11b2.44bc2.47bc2.32bc4.68a绿弯菌门 Chloroflexi2.14b3.31a2.90a2.69ab2.15b1.91b2.29b硝化螺旋菌门 Nitrospirae1.67a1.48ab1.26bc1.06cd0.96d1.06cd1.17cd厚壁菌门 Firmicutes0.94b1.33a1.67a0.96b0.781b1.074b0.89b蓝藻门 Cyanobacteria0.29b1.10b3.75b12.15a0.220b0.93b0.24b热微菌门 Thermomicrobia0.33c0.34c0.58b0.31c0.78a0.37c0.47bc其它 Others2.313.303.432.663.091.993.09

注：同一行不同小写字母表示处理间差异达到显著水平(P< 0.05)

Note：Different lowercase letters within the same row indicate significant difference (P< 0.05)

盐碱胁迫处理明显影响土壤细菌门水平群落结构。三种盐碱胁迫(NaCl、Na2SO4、Na2CO3+NaHCO3)土壤细菌的拟杆菌门(Bacteroidetes)和浮霉菌门(Planctomycetes)增加；而放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)减少。此外，NaCl胁迫处理(C2)绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、热微菌门(Thermomicrobia)、绿菌门(Chlorobi)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、Saccharibactreia等增加明显；而酸杆菌门(Acidobacteria)、热袍菌门(Thermotogae)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、SHA-109表现为低促高抑。Na2SO4胁迫处理(S2)芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、热微菌门(Thermomicrobia)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)增加，而酸杆菌门(Acidobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、Parcubacteria、WD272为低促高抑。Na2CO3+NaHCO3碱胁迫处理(A2)酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、装甲菌门Armatimonadetes)增加。表3，图3

图3 土壤细菌群落门水平的聚类分析热图

Fig.3 Heatmap of dominant bacterial phylum in soil

2.4 盐碱胁迫对细菌群落属水平的影响

通过序列比对得到各样品中相对丰度较高的前100个菌属，其中7个属的平均相对丰度>1%，占样品总序列的14.72%(8.92%～25.21%)。7个属分别为鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)(3.26%)、unidentified_Chloroplast(2.62%)、Pontibacter(2.27%)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)(2.02%)、不动杆菌属(Acinetobacter)(1.91%)、黄杆菌属(Xanthomonas)(1.59%)和Flavisolibacter(1.06%)。图4

图4 土壤细菌群落属水平的相对丰度

Fig.4 The relative abundance (%) of bacterial genera in soil

不同盐碱处理土壤主要细菌属的相对丰度差异明显。NaCl胁迫处理(C1、C2)菌属的变化相对较小。Na2SO4胁迫处理(S1、S2)黄杆菌属(Xanthomonas)、假单胞菌属(Pesudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、Simiduia、固氮菌属(Azotobacter)增加。Na2CO3+NaHCO3碱胁迫处理(A1、A2)芽单胞菌属(Gemmatimonas)、Pontibacter、丰祐菌属(Opitutus)、Blastocatella、纤维弧菌属(Cellvibrio)的相对丰度较高。图5

图5 土壤细菌群落属水平的聚类分析热图

Fig.5 Heatmap of dominant bacterial genera in soil

3 讨 论

土壤盐碱化是土地退化的主要类型之一，已成为全球关注的热点问题[21]。土壤盐渍化以及因灌溉引起的土壤次生盐渍化问题是我国干旱、半干旱区所面临的主要生态环境问题[22]。土壤微生物能预警和敏感地指示农田土壤生态系统的变化，是评价土壤质量的重要指标。国内外针对不同盐分和pH梯度下土壤细菌群落变化已经开展了一定研究[23-27]。盐碱类型和盐碱度是影响盐碱土壤微生物群落结构的主要生态因子[25]，但是关于不同盐碱类型及盐碱化程度下土壤细菌群落多样性和群落结构的研究还很少。研究表明不同盐碱胁迫对土壤细菌群落α-多样性Shannon指数和Simpson指数影响无显著影响。Herlemann等[28]和Wang 等[29]报道水体中细菌群落α-多样性Shannon指数并不随盐度的增加而降低，可能是细菌对盐渍环境有很快的适应能力。Andronov等[25]对哈萨克斯坦Akkol湖附近盐渍土壤(以195 km外的非盐渍化耕地土壤为对照)细菌群落结构的研究结果也表明，所有样品的细菌群落α-多样性Simpson指数相似。但也有研究指出细菌群落多样性Shannon指数随土壤盐度增加而降低，尤其高盐度土壤较低盐度显著降低；Chao1指数在两个季节变化不一致。这种差异可能与土壤的盐分类型以及盐度有关。研究也发现NaCl盐化处理土壤Chao1和Ace丰富度指数无明显变化，Na2SO4和Na2CO3+NaHCO3处理土壤Chao1和Ace丰富度指数显著降低。

细菌群落β-多样性分析结果表明不同盐碱胁迫处理土壤细菌群落结构差异显著。总体上，不同处理土壤细菌优势门类为变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，其中变形菌门的相对丰度最高。这与大部分研究结果一致[26, 30-32]。

从不同盐碱胁迫处理土壤细菌群落的组成结构来看，三种盐碱胁迫下拟杆菌门(Bacteroidetes)显著增加。有研究表明拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度与土壤盐度呈显著正相关[26]，对高盐环境具有较强的抗性，是盐碱土中的优势种群[33]。此外，盐碱胁迫下浮霉菌门(Planctomycetes)相对丰度也呈增加趋势，尤其是Na2CO3+NaHCO3碱胁迫处理(pH=8.16～9.92)增加较为显著。但有研究表明浮霉菌门(Planctomycetes)相对丰度和土壤pH(6.9～8.0)呈显著负相关[26]。研究发现三种盐碱胁迫下放线菌门(Actinobacteria)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)显著减少，这与Campbell和Kirchman[32]的研究结果相同。Zheng等[27]认为硝化螺旋菌对盐分比较敏感，高盐环境下显著减少。有研究报道酸杆菌门(Acidobacteria)在低盐度条件下增加，而在高盐条件下降低[27, 34]。这与研究中NaCl 和Na2SO4盐化处理土壤的趋势一致，但Na2CO3+NaHCO3中度碱化处理(A2)酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度显著高于轻度碱化(A1)和非碱化处理(CK)。厚壁菌门(Firmicutes)具有较强的抗盐性，在高盐土壤中的相对丰度大于中盐和低盐土壤[27]。但也有研究表明厚壁菌门(Firmicutes)是盐渍土壤中常见的细菌门类，但其相对丰度与盐分梯度之间的相关性不显著[26]。研究表明，厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度在NaCl 盐化处理土壤显著增加，而Na2SO4和Na2CO3+NaHCO3盐化处理土壤无显著变化。芽单胞菌门(Gemmatimonodates)的很多成员在生物地球化学转化过程中都具有很活跃的作用，尤其是在高盐土壤中[35]。研究发现高盐土壤中芽单胞菌门(Gemmatimonodates)的相对丰度明显高于低盐度土壤[26]。研究中Na2SO4中度盐化处理(S2)的土壤含盐量最高(6.43 g/kg)，其芽单胞菌门(Gemmatimonodates)的相对丰度也最高。Ma和Gong[31]研究表明，变形菌门(Proteobacteria)是盐渍土壤中最普遍的细菌门类，其中γ-变形菌纲为主导(53.7%)，其次是α-变形菌纲(29.3%)和 δ变形菌纲(12.2%)。变形菌门(Proteobacteria)具有较好的耐盐性[27]，尤其γ-变形菌纲的不动杆菌属(Acinetobacter)包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属于耐盐细菌[36]。因此，盐碱胁迫下土壤细菌群落结构变化显著，细菌群落的物种组成会发生演替以适应盐碱环境。不同盐碱类型和盐碱度胁迫会导致土壤细菌群落形成显著差异物种。

4 结 论

不同盐碱胁迫对土壤细菌群落α-多样性Shannon指数和Simpson指数影响无显著影响，但Na2SO4和Na2CO3+NaHCO3胁迫土壤Chao1和Ace丰富度指数显著降低。盐碱胁迫显著影响细菌群落β-多样性，除NaCl轻度盐化土壤细菌群落结构与对照(CK)差异不明显外，其它盐碱胁迫土壤细菌群落结构变化显著。各处理土壤细菌优势门类均为变形菌门、芽单胞菌门、放线菌门、酸杆菌门和拟杆菌门。盐碱胁迫土壤细菌的拟杆菌门、浮霉菌门增加；而放线菌门、硝化螺旋菌门减少。