牛冠状病毒核衣壳蛋白原核表达及鉴定

陆亚冬，刘贤侠，陈创夫

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】牛冠状病毒(Bovine Coronavirus，BCV)系冠状病毒科冠状病毒属成员，其感染对象是脊椎动物，常常是引起10日龄以下初生犊牛腹泻，由牛冠状病毒引起的牛冠状病毒病，是一种以胃肠炎为主要症状的，高度接触性传染病，经口感染为主，其传染源主要是腹泻犊牛的粪便被健康犊牛舔食，引起初生犊牛腹泻，治愈率低，目前尚无有效的治疗药物和疫苗，对小肠绒毛上皮的损害十分严重[1]，抗原性方面牛冠状病毒和其他冠状病毒之间具有部分交叉性。冠状病毒很容易产生变异，自身不稳定，诊断和预防该病很困难。【前人研究进展】目前尚无有效的治疗药物和疫苗，牛冠状病毒对小肠绒毛上皮的损害十分严重[1]，抗原性方面牛冠状病毒和其他冠状病毒之间具有部分交叉性。冠状病毒很容易产生变异，自身不稳定，诊断和预防该病很困难。目前常规检测方法不适合临床的大规模应用，费用高。【本研究切入点】应用PCR和ELISA方法对新疆部分地区规模化牛场进行致犊牛腹泻冠状病毒病的初步调查，应用原核表达蛋白纯化技术对牛冠状病毒核衣壳蛋白进行初步研究，核衣壳蛋白是牛冠状病毒主要结构蛋白，常作为检测抗原，在病毒侵染宿主方面起着扮演着重要的角色，可作为诊断牛冠状病毒病的候选蛋白。【拟解决的关键问题】牛冠状病毒N 基因表达的N蛋白比较保守，既可以作为冠状病毒病的诊断方面用的抗原，又具有很强的免疫原性[2]。研究建立一种快速诊断的试剂盒或试纸条奠定一定理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

E.coliDH 5α菌株、BL21(DE3)菌株和原核表达载体PET-28a、PET-32a菌株均由石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存；PMD19-T载体购自宝生物(大连)公司。

牛冠状状病毒阳性病料采自新疆部分规模化牛场；IPTG购自MerK公司；限制性内切酶(EcoRI/HindIII)、T4连接酶、DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司；质粒小提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、HRP标记的山羊抗牛IgG、广谱彩虹预染Marker，His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)，His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)购自北京康为世纪生物科技有限责任公司；牛冠状病毒标准阳性血清购自青岛瑞尔公司；牛冠状病毒阳性血清采集自新疆北疆地区部分发病犊牛规模化场，经牛冠状病毒抗原检测ELISA试剂盒鉴定。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计及合成

采集石河子周边、沙湾、奎屯等部分地区规模化牛场腹泻犊牛粪便样品141份，健康犊牛粪便若干份。所采集的腹泻犊牛病程大多在10日龄以内。根据GenBanK中(登录号：318090.1)Mebus株N基因保守序列设计3对特异性引物，扩增牛冠状病毒部分基因的引物，同时设计引物进行原核表达，上游引物含有EcoRΙ位点，下游引物含有HindⅢ位点，引物由上海生物工程股份有限公司合成。表1，表2

表1 牛冠状病毒部分基因引物信息

Table 1 Partial gene primer information of bovine coronavirus

名称Name引物序列(5’-3’)Primer sequence (5 '-3')扩增大小Amplification size (bp)退火温度TmBCV-N-F1CGGGATCCATGTCTTTTACTCCTGGTBCV-N-F2CCGCTCGAGTTATATTTCTGAGGTGT1 34758℃BCV FATACCCCGGCTGACATTCTCGBCV RCTCTTCTGGCGGGGCTTATTCA 35555℃

表2 PCR引物序列

Table 2 Nucleotide sequences of PCR primers

引物名称Primer name序列(5’-3’)Sequence (5 '-3')扩增长度Amplification length (bp)退火温度TmBCV -N-FCGAATTCATGTCTTTTACTCCTGGTAAGCABCV -N-RCCAAGCTTTTATATTTCTGAGGTATCTTCAGTAAAGG1 40058℃

1.2.2 牛冠状病毒抗原ELISA检测

(1)试剂准备：按照说明书操作，使用前所有试剂恢复至室温。

(2)操作步骤：按照牛冠状病毒抗原ELISA说明书进行，试剂盒原理是双抗体夹心法，将处理好的样品上清液吸取200 μL加入已经预先包被牛冠状病毒捕获抗体的微孔中，同时设置阴阳性对照孔和空白孔，除空白孔外，样品孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，微量震荡仪器上进行震荡混匀，用封板膜封好后置于37℃恒温培养箱中作用1 h，取出弃掉微孔中的液体，每孔用洗涤液洗板5次，每次2 min，加入底物后避光孵育15 min，用终止液进行终止，在450 nm的酶标仪上进行读数。

1.2.3 牛冠状病毒 N基因的扩增、克隆、测序及鉴定

用Trizol法提取牛冠状病毒病料的RNA，以此为模板进行PCR反应。采用25 μL反应体系：ddH2O 9.7 μL、上下游引物各0.4 μL、模板2.0、2×EsTaqMasterMiX 12.5 μL空白对照：模板改为水。反应条件：预变性95℃ 5 min，变性94℃ 40 s，退火64℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，重复30个循环，再延伸 72℃ 10 min，4℃保存。扩增后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收。将N基因PCR产物与pMD19-T载体相连，连接产物转化入DH5α感受态细胞。筛选阳性克隆，小提质粒并进行EcoRΙ/HindⅢ双酶切，获得目的基因片段，切割胶回收N DNA片段和PET-28a和PET-32a酶切产物。将回收的N基因片段与表达载体PET-28a和PET-32a于16℃连接过夜。将连接产物转入DH5α感受态细胞，涂于培养基板上，37℃过夜培养16～18 h，选取生长良好的转化菌落，进行筛选后提取PET -28a-N质粒和PET-32a-N质粒，并将筛选后经双酶切鉴定目的条带正确的质粒送上海生物工程股份有限公司进行测序，并将测序结果用DNAMAN软件进行在线比对，并将其转化入BL(DE3)感受态细胞，涂于含有卡那霉素(PET-28a-N)的培养基板上和氨苄霉素(PET-32a-N)的培养板上。37℃过夜培养16～18 h，选取生长良好的转化菌落，进行筛选。经酶切鉴定后重组表达载体命名为PET-28a-N和PET-32a-N。

1.2.4 牛冠状病毒 N基因在大肠杆菌中的诱导表达

将阳性克隆菌接种到含有抗性(100 mg/L)LB液体培养基中，37℃ 220 r/min摇菌过夜。吸取200 μL菌液接种到20 mL含有抗性的LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养至菌液旺盛期，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达，分别于2、4、6、8 h取样。同时设空载体和未加IPTG诱导的重组菌作为对照。

1.2.5 重组蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3的上清/包涵体鉴定及纯化

经SDS-PAGE鉴定条带正确的重组蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3，分别用2 L的三角瓶进行批量诱导后进行收菌，加入适量的裂解液进行过夜裂解，裂解菌体之后，取1 mL菌液分装到1.5 mL离心管中， 8 000 r/m离心30 min，分别取上清和沉淀，进行15%SDS-PAGE进行电泳，鉴定上清和沉淀。重组蛋白的纯化采用His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)、His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)主要操作步骤：

缓冲液的准备

包涵体蛋白纯化缓冲液配方。表3

表3 包涵体蛋白纯化缓冲液配方

Table 3 Formulation of inclusion body protein purification buffer

组分ComponentTris-HCl(pH7.9)ImidazoleNaClUreaBinding Buffer20 mM5 mM0.5M8MElution Buffer20 mM500 mM0.5M8M

组装层析柱，将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10 min，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出．向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用8倍柱体积的 Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。包涵体蛋白的纯化，收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入2 mL 8 M尿素进行变性，过夜裂解，超声裂解菌体。10 000×g，4℃离心15 min，分离上清和沉淀，并收集沉淀，将沉淀重悬于Binding Buffer中，尽量混匀使包涵体充分溶解。10 000×g离心20 min，收集上清。将离心后的上清以孔径为0.45 μm的滤膜过滤。将上清负载上柱，流速为10倍柱体积/h，收集流穿液。使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。洗脱后，依次使用5倍柱体积的Binding Buffer，5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。

包涵体形式得到的蛋白需要进行复性即在8M尿素变性后得到的变性条件下目的蛋白需要复性，将目的蛋白放到透析带中，进行梯度透析分别是6M尿素透析、4M尿素透析、2M尿素透析、1M尿素透析和去离子水透析，时间分别是6～8 h，最后用蔗糖吸干，分装保存。

His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)主要操作步骤。表4

表4 可溶性蛋白纯化缓冲液配方

Table 4 Formula for soluble protein purification buffer

组分ComponentTris-HCl(pH7.9)ImidazoleNaClBinding Buffer20 mM10 mM0.5MElution Buffer20 mM500 mM0.5M

组装层析柱：将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10 min，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以1 mL填料纯化20～30 mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。可溶性蛋白的纯化，收集菌体后，每100 mg菌体湿重加入1～5 mL细菌裂解液，每1 mL细菌抽提试剂中已加入10 μL蛋白酶抑制剂混合物，超声裂解菌体。超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可，10 000 r/m，4℃离心3 min，收集上清中的可溶性蛋白。用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/h，收集流穿液。使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用适量Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡乙醇要将填料浸没，封柱后2～8℃保存。

可溶性蛋白和包涵体蛋白纯化方式主要是确定Bingding Buffer(组分Tris-HCl、immdazol、NaCl)和Elution Buffer(组分Tris-HCl、immdazol、NaCl)的中的咪唑的浓度，使用梯度咪唑浓度洗脱蛋白，通过SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的纯度和活性。

1.2.6 重组蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3的Western blot分析

将收集的菌液，10 000 r/min离心1 min 后弃去上清，加入20 μL 5×上样缓冲液和80 μL去离子水悬浮菌体煮沸10 min，进行SDS- PAGE电泳。用考马斯亮蓝染色鉴定牛冠状病毒N蛋白的表达。使用半干式转膜仪，将SDS-PAGE凝胶上的蛋白样品转印到0.45 μm NC 膜上(300 mA，50 min)，用Western blot膜封闭液封闭1 h,TBST洗涤3次，每次5 min，加入稀释的牛冠状病毒阳性血清，37℃孵育2 h,TBST 洗涤3～5次，每次5～10 min，加入1∶4 900稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗牛IgG，孵育2 h，TBST洗涤3～5次，每次5～10 min ，加入DAB显色液进行显色反应，于显色完成后用水终止。

2 结果与分析

2.1 PCR检测牛冠状病毒

应用PCR方法对新疆部分地区主要规模化牛场腹泻犊牛粪便样品141份，阳性份数87份，总阳性率：61.7%，扩增出预期的目的片段大小，进行测序，测序结果显示N基因的序列与标准序列同源性达到98.22%，同源性较高，说明检测的犊牛样品中含有冠状病毒。

牛冠状病毒主要的结构蛋白基因是N基因，N基因高度保守,可作为诊断BCV的候选基因。PCR检测结果表明新疆部分地区腹泻犊牛遭受冠状病毒感染。图1，图2，表5

表5 新疆部分地区主要规模化牛场腹泻犊牛粪便样品RT-PCR阳性检测结果

Table 5 The main part of Xinjiang area scale test results positive fecal samples of RT-PCR cattle calf diarrhea

主要规模化牛场Major scale cattle farm样品总数Number of samples阳性份数Positive number阳性率Positive rate (%)石河子某A规模化牛场12650.00沙湾县某A规模化奶牛场111090.90沙湾某B规模化牛场16743.75沙湾某C规模化牛场10550.00奎屯某A规模化牛场232295.65奎屯某B规模化牛场8675.00奎屯某C规模化牛场8450.00奎屯某D规模化牛场9888.88奎屯某E规模化牛场11545.45奎屯某F规模化牛场1218.30奎屯某G规模化牛场11763.63沙湾某B规模化牛场10660.00总计1418761.70

注：*上述健康犊牛血清采集石河子某试验站

Note：

注：M:Maker；12：阴性对照；1～4、8未扩增出牛冠状病毒基因；5～7、9～11：牛冠状病毒N基因克隆产物

Note： M:Maker; 12: negative control; 1-4 and 8 did not amplify the coronavirus gene; 5-7, 9-11: Bovine coronavirus N gene clone product

图1 某A规模化牛场腹泻犊牛粪便冠状病毒基因扩增

Fig.1 A scale cattle feces of calves diarrhea coronavirus gene amplification detection results

注：M:Maker；19：阴性对照；1～18、20～24：均扩增出牛冠状病毒N基因部分基因355 bp

Note： M:Maker; 19: Negative control; 1-18, 20-24: All the N genes of bovine coronavirus were amplified by partial 355 bp gene

图2 某B规模化牛场牛场腹泻犊牛粪便样品冠状病毒基因扩增

Fig.2 B large-scale dairy cattle calves fecal samples of diarrhea coronavirus gene amplification detection results

2.2 ELISA检测

(1)检测新疆部分地区主要规模化牛场腹泻犊牛样品 141份，阳性数99份，阳性率70.21%。表6

2.3 牛冠状病毒N基因的扩增

用BCV- N-F/BCV- N-R引物扩增N基因，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测到约1 400 bp条带，与预期结果相符。图3

表6 新疆部分地区主要规模化牛场腹泻犊牛粪便样品双抗体夹心法ELISA阳性检测

Table 6 The main part of the Xinjiang scale of dairy calves diarrhea stool samples of double antibody sandwich ELISA positive test results

主要规模化牛场Major scale cattle farm样品数Number of samples阳性数Positive number阳性率Positive rate (%)石河子某A规模化牛场121083.33沙湾县某A规模化奶牛场11981.81沙湾某B规模化牛场161487.50沙湾某C规模化牛场10880.00奎屯某A规模化牛场232191.30奎屯某B规模化牛场8225.00奎屯某C规模化牛场8562.50奎屯某D规模化牛场9444.00奎屯某E规模化牛场111090.90奎屯某F规模化牛场12216.66奎屯某G规模化牛场11981.00沙湾某B规模化牛场10550.00总计1419970.21

注：健康犊牛血清采集自石河子某实验站

注：M:DNA 标准MarKer 5 000;1、3：N基因产物；2：阴性对照

Note： M:DNA standard MarKer 5,000; 1, 3:N gene products; 2: Negative control

图3 N基因的扩增结果

Fig.3 The amplification result of N gene

2.4 鉴定重组克隆载体PMD 19-T-N

分别采用双酶切法鉴定重组质粒PMD19-T-N,用EcoRΙ/HindⅢ酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测到约1 400 bp片段和约4 000 bp处可见清晰条带，与预期结果一致。图4

2.5重组原核表达载体PMD19-T-28a-N和PMD19-T-32a-N的双酶切及测序结果鉴定

将PMD19-T-28a-N 用EcoRΙ/HindⅢ双酶切鉴定，以2.0%琼脂糖凝胶电泳分析，结果分别在1 400 bp和5 369 bp出可见清晰条带(图5)和(图6)，同时将保守序列测序结果与牛冠状病毒N基因标准毒株Mebus株基因序列应用DNAMAN软件进行在线比对同源性达到98.22%(部分测序结果图7)。图5～7

注：M：DNA 标准MarKer 5 000 bp.1、2、3、4、5双酶切后的目的条带；6：未进行双酶切的PMD19-T-N质粒

Note： M:DNA MarKer 5,000 bp.1, 2, 3, 4, 5 after double digestion to strip; 6: NO PMD19-T-N plasmid double digestion

图4 PMD19-T-N 酶切鉴定结果

Fig.4 Enzyme digestion of PMD19-T -N

2.6 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测

重组菌经IPTG诱导，SDS-PAGE经分析表明，目的蛋白成功表达，重组蛋白相对分子质量约为54KD，与理论分析值相符。图8

2.6.1 重组BCV-N-28a-DE3蛋白上清或包涵体的鉴定(图9)

注：M：5 000 bp Maker.1、2、3：双酶切后的目的条带；4：未进行双酶切的阴性对照

Note： M:5,000 bp Maker.1, 2, 3: Target bands after double enzyme digestion; 4: Negative control without double enzyme digestion

图5 PMD19-T-28a-N 酶切鉴定

Fig.5 Enzyme digestion of PMD19-T-28a-N

注：M：5 000 bp Maker.1、2：双酶切后的目的条带；3：未进行双酶切的阴性对照

Note： M:5,000 bp Maker.1, 2: Target bands after double enzyme digestion; 3: Negative control without double enzyme digestion

图6 PMD19-T-32a-N 酶切鉴定

Fig.6 Enzyme digestion of PMD19-T-32a-N

图7 牛冠状病毒N基因保守序列测序结果部分

Fig.7 Sequence map of N gene of bovine coronavirus

注：M:蛋白分子质量标准。1、2、3、4加IPTG诱导的重组菌；5:PMD19-T-28a-N未诱导对照

Note： The molecular weight standard of M: protein. 1, 2, 3, 4 and IPTG induced recombinant bacteria; 5:PMD19-T-28a-N was not induced

图8 重组蛋白 PMD19-T-28a-DE3-N SDS-PAGE分析

Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant protein of PMD19-T-28a-DE3-NSDS-PAGE

注：2～6为蛋白表达在上清，1、7～9为蛋白表达在包涵体

Note： Description: 2-6 protein was expressed in supernatant, 1 and 7-9 were expressed in inclusion bodies

图9重组BCV-N-28a-DE3蛋白上清或包涵体的鉴定

Fig.9 Identification of recombinantBCV-N-28a-DE3proteinsupernatantorinclusionbody

2.6.2 BCV-N-32a-DE3蛋白的诱导表达及SDS-PAGE鉴定

对加入诱导剂的菌进行不同时间段收菌，同时设置未加诱导剂的作为对照，经SDS-PAGE进行蛋白表达及表达量的鉴定。图10

注：M:蛋白分子质量标准；1～4:32a-N诱导2、4、6、8 h; 5:32a-N未诱导；6～7:32a-DE3未诱导

Note： M: Protein molecular quality standard; 1-4:32a-N induced 2, 4, 6, and 8h.5:32a-N did not induce; 6-7:32a-DE3 was not induced

图10 BCV-N-32a-DE3蛋白的诱导表达及SDS-PAGE鉴定

Fig.10InducibleexpressionofBCV-N-32a-DE3proteinandidentificationofSDS-PAGE

2.6.3 BCV-N-32a-DE3蛋白表达的上清或包涵体鉴定(图11)

注：M:广谱彩虹预染Maker; 说明：1～7为包涵体表达，9～11为上清表达

Note： M: Broad-spectrum rainbow pre staining Maker; Description: 1-7 For inclusion body expression, 9-11 For supernatant expression

图11 BCV-N-32a-DE3蛋白表达的上清或包涵体鉴定

Fig.11 Identification of the supernatant or inclusion body of the expressionofBCV-N-32a-DE3protein

2.6.4 BCV-N-28a-DE3表达的蛋白纯化结果

目的蛋白纯化后目的蛋白的大小与理论值相符约54 KD。图12

注：M:广谱彩虹预染Maker;1：对照；2～4为500 mmoL咪唑洗脱下蛋白纯化的结果

Note： M: Broad-spectrum rainbow pretreated Maker; 1: Contrast; 2-4 purified by 500mmol imidazole eluted protein

图12重组表达蛋白BCV-N-28a-DE3表达的蛋白纯化

Fig.12 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-28a-DE3

2.6.5 BCV-N-32a-DE3表达的蛋白纯化结果

全菌采用50 mM Tris-HCL(pH=7.9)，300 mM NaCl，50 mM Imidazole含1%的TritonX-100，1 mM DTT，1 mMPMSF超声裂解，同时以50 mM Tris-HCL(pH=7.9)，300 mM NaCl，50 mM Imidazole平衡Ni柱之后用250 mmol、500 mmol咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白，并收集每个洗脱组分,整个过程在低温下操作，进行SDS-PAGE分析检测。图13，图14

注：M：广谱彩虹预染Marker,2～6为250 mmoL咪唑洗脱下目的蛋白纯化的结果

Note： M: Broad spectrum rainbow pre dye Marker, 2-6 Purified result of 250mmol imidazole eluted target protein

图13重组表达蛋白BCV-N-32a-DE3表达的蛋白纯化

Fig.13 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-32a-DE3

注：M：广谱彩虹预染Marker，1～4、5～12、17～21为500 mmoL咪唑洗脱下目的蛋白纯化的结果

Note： M: Broad-spectrum rainbow pre dye Marker, 1-4, 5-12, 17-21 for 500mmol imidazole eluted target protein purification results

图14重组表达蛋白BCV-N-32a-DE3表达的蛋白纯化

Fig.14 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-32a-DE3

2.7牛冠状病毒重组表达BCV-N-28a-DE3和BCV-N-32a-DE3的Western blot鉴定

重组菌表达产物通过Western blot进行分析。其结果显示，在54 KD处有明显条带，与预期值相符，在70 KD处有明显条带，同样与预期值相符Western blot分析结果表明，表达的重组N蛋白可以与牛冠状病毒阳性血清发生特异性免疫学反应，证实表达的重组N蛋白具有良好的反应原性。图15，图16

2.7.1 重组表达 BCV-N-28a-DE3蛋白的Western blot的鉴定

注：M:蛋白质分子标准质量 Marker；1、2纯化后的PMD19-T-28a-DE3-N 融合蛋白

Note： M: Protein molecular standard mass Marker; 1 and 2 purified PMD19-T-28a-DE3-N fusion protein

图15 融合蛋白的Western blot分析

Fig.15 Western blot analysis of fusion protein

注：M:蛋白质分子标准质量 Marker；1～4：纯化的重组蛋白N与牛冠状病毒阳性血清发生反应(阳性血清浓度：分别是1～2，1:100；3～4,1:50)。5～6：纯化的重组蛋白N与牛阴性血清不发生反应

Note： M: Protein quality standard Marker; 1-4: Recombinant protein N and Bovine coronavirus positive serum purified reaction (positive serum concentration were 1-2, 1:100; 3-4,1:50). 5-6: Purified recombinant protein N did not react with bovine negative serum

图16 重组表达纯化的蛋白BCV-N-28a-DE3Western blot分析

Fig.16 Recombinant expression and purificationofproteinBCV-N-28a-DE3Westernblotanalysis

注：M：蛋白质分子标准质量；1：纯化的重组蛋白N与牛冠状病毒标准阳性血清发生反应

Note： M: Protein molecular standard quality; 1: Purified recombinant protein N reacted with bovine coronavirus standard positive sera; Analysis of recombinant expression and purification protein BCV-N-28a-DE3 Western blot

图17 重组表达纯化的蛋白BCV-N-28a-DE3Western blot分析

Fig.17 Recombinant expression andpurificationofproteinBCV-N-28a-DE3Westernblotanalysis

2.7.2 重组表达 BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鉴定

注：M：蛋白质分子标准质量；1～5：重组蛋白N与牛冠状病毒阳性血清发生反应

Note： M: Protein molecular standard quality; 1-5: Recombinant protein N reacts with bovine coronavirus positive serum

图18重组表达BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鉴定

Fig.18 Identification of recombinant WesternblotexpressingBCV-N-32a-DE3protein

注：M:蛋白质分子标准质量 Marker;1～4：重组蛋白与牛冠状病毒标准阳性血清发生反应

Note： M: Protein molecular standard mass Marker; 1-4: Recombinant protein and Bovine coronavirus standard positive serum reaction

图19重组表达BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鉴定

Fig.19 Identification of recombinant WesternblotexpressingBCV-N-32a-DE3protein

3 讨 论

研究从新疆部分地区采集规模化牛场中采集腹泻犊牛的粪便，对采集的粪便进行恰当的处理，应用牛冠状病毒抗原检测试剂盒检测新疆部分地区主要规模化牛场腹泻犊牛样品 141份，阳性数99份，阳性率70.21%。应用PCR方法对新疆部分地区主要规模化牛场腹泻犊牛粪便样品141份，阳性份数87份，总阳性率为61.7%，综合PCR方法和ELISA方法的检出结果感染牛冠状病毒腹泻犊牛粪便阳性率在61.7%～70.21%，这与张坤等[8]运用PCR和ELISA方法对新疆北疆部分地区规模化牛场冠状病毒感染率略高，研究对新疆部分地区规模化牛场腹泻犊牛粪便中病原的调查具有一定的参考意义。

BCV是20世纪70年代初期发现的导致犊牛腹泻病毒的主要病原之一，是引起新生犊牛出血性腹泻,表现为急性大规模的爆发与流行，剧烈腹泻，持续时间长、犊牛急剧消瘦、排喷射状的粪便导致脱水严重、排黑色粪便中带血，另有研究表明，犊牛肠道感染和呼吸道感染可能由同一型BCV引起的感染[3、4]。犊牛腹泻病原有细菌、病毒、寄生虫等均可导致犊牛腹泻，给畜牧业造成了极大的损失。1972年Mebus等[5]在成年牛和犊牛的腹泻物中通过电镜法检出BCV，1985年宋广林等[6]、1990年姚火春等[7]对于冠状病毒在我国的存在和流行进行了研究。张坤等[8]进行了牛冠状病毒的分子流行病学调查，并绘制了系统发生树，对核苷酸同源性的问题作了介绍。

冠状病毒是目前已知RNA病毒中最大的病毒，使得人和多种动物易于感染，冠状病毒基因组极易发生重组，在基因组的结构特征方面牛冠状病毒呈现遗传的多样性。N蛋白构成牛冠状病毒的核衣壳，是病毒的主要结构蛋白，与病毒的致病性方面有关。乔军等[9]研究表明N蛋白其结构蛋白中保守性很高的蛋白，发现其N蛋白具有高度螺旋结构，与Motokawa等[10]的研究一致。为了证明N蛋白在复制、翻译、致病性等方面起作用，基于体外的复制实验，从RNA复制、加工中发现牛传染性胃肠炎结构蛋白N蛋白所制备的抗血清，在体外复制实验时发现能抑制90%的基因的合成。说明N蛋白在致病性、复制及翻译过程中起作用。N蛋白发现牛在感染该病毒早期，体内就能产生抗蛋白的高水平抗体，N蛋白是病毒的主要免疫原蛋白之一，可诱发机体产生有效的免疫应答。在糖基化修饰，蛋白折叠的影响方面，冠状病毒N蛋白的主要抗原表位，不受糖基化的修饰，蛋白折叠的影响，可应用常规的原核表达系统进行表达，而且表达量很高，Seo和Seah等[11-12]、Peng 等[13]等分别对在研究鸡传染性支气管炎病毒、嵌合小鼠肝炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒N蛋白时发现：N蛋白与CTL表位和B细胞表位，病毒的组织嗜性有关的区域及抗原位点有关。冠状病毒的N蛋白是高度保守、抗原性和免疫原性比较强、N蛋白在BCV不同毒株间变异小并且在病毒RNA的包装和复制中起重要作用的核衣壳蛋白，在病毒感染中可大量表达，核衣壳蛋白可作为病毒感染的靶抗原，具有重要的意义。由于冠状病毒核衣壳蛋白N基因序列高度保守，可用于基因分型的鉴定。这与张婉琪等[14]利用同源性分析的研究发现N蛋白高度保守，而在不同属冠状病毒之间保守性很低且不完全一致。

4 结 论

4.1 应用PCR和ELISA方法对新疆北疆部分地区规模化牛场中致犊牛腹泻主要病原冠状病毒进行了调查，发现有较高的感染率，对规模化牛场采取积极的防控提供依据。所采集141份腹泻犊牛粪便中，用ELISA检测阳性率70.21%；再用PCR检测出阳性率为61.7%。犊牛冠状病毒是导致石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场和部分肉牛场犊牛腹泻的主要病原；ELISA方法和PCR方法结合应用检测犊牛冠状病毒效果具有参考意义。

4.2 在PET-28a和PET-32a原核表达系统中高效表达了BCV N蛋白，并进行了免疫印迹实验，N蛋白具有很强的免疫反应性。