吡格列酮对高糖诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞晚期糖基化终末产物受体表达的影响及机制

高红丽 辛毅 李卫萍 沈絮华 邸北冰 李虹伟

100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院心血管中心(高红丽、李卫萍、沈絮华、邸北冰、李虹伟)；100029 北京，首都医科大学附属北京安贞医院细胞培养室(辛毅)

研究表明，持续高血糖可引起体内多种蛋白质非酶糖基化，形成的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)在糖尿病慢性并发症的发病中起重要作用。AGEs的特异性受体——晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)最为重要。AGEs与RAGE相互结合加速了动脉粥样硬化的发生和发展[1]。研究表明，在RAGE基因敲除的糖尿病小鼠中，动脉粥样硬化斑块面积明显减轻。因此，抑制RAGE可减缓糖尿病导致的动脉粥样硬化进程。吡格列酮(pioglitazone，PIO)可激动过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ)，抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖。但鲜有报道PIO能否抑制高糖环境下的RAGE表达，且作用机制目前尚不清楚。本研究通过体外培养的VSMCs，探讨PIO对高糖诱导的小鼠VSMCs中RAGE表达的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重15～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。PIO、GW9662、RAGE抗体及PPAR-γ抗体(Abcam公司)；牛血清白蛋白、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma公司)；DMEM培养液、特级胎牛血清、0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(Gibco公司)；羊抗鼠α平滑肌肌动蛋白、异硫氰酸罗丹明标志兔抗羊二抗(Santa Cruz 公司)。超净工作台(北京昌平长城净化空气仪器厂)，二氧化碳培养箱(Thermo，Heracell 240，德国)，台式离心机(上海安亭科学器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养及鉴定 颈椎脱臼处死小鼠，置于75%乙醇中浸泡2 min，固定后依次剪开胸腹部皮肤、肌肉层及胸骨，暴露胸腹腔，紧靠脊柱前方无菌条件下取出胸、腹主动脉，取主动脉中膜剪成约1 mm×1 mm的组织块备用。将小组织块放入 50 ml离心管中，加入2.5 g/L胰蛋白酶和2 g/LⅡ型胶原酶(1∶1)联合消化液各10 ml消化细胞，收获的细胞收集于离心管中，离心后的细胞接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱内继续培养。当原代培养的VSMCs生长至70%融合后(约7～10 d)即可传代，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。实验选用第4～6代的细胞。培养的第2代细胞，经SM-α-actin 免疫荧光化学染色确定为平滑肌细胞。

1.2.2 细胞分组及处理 取上述平滑肌细胞生长至融合状态后，将主动脉平滑肌细胞种植到含有10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养48 h(每孔3×105细胞)，改用无胎牛血清的DMEM培养基同步化24 h。

将细胞分为5组进行处理：(1)5.5 mmol/L葡萄糖(正常浓度葡萄糖组，NG)；(2)25 mmol/L 葡萄糖(高浓度葡萄糖组，HG)；(3)25 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L PIO(HG+PIO)；(4)25 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L PIO+ 10 μmol/L GW9662(HG+PIO+GW9662)；(5)25 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L GW9662(HG+ GW9662)。每组设3个复孔。

细胞处理24 h后收集细胞，提取细胞总mRNA，进行逆转录；提取细胞总蛋白，进行Western blot检测。PIO为PPAR-γ的激动剂，GW9662为PPAR-γ特异性抑制剂。以上实验重复3次取平均值。

1.2.3 RAGE及PPAR-γ的mRNA的提取及转录 用超纯RNA提取试剂盒提取细胞样本中总mRNA。用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744)进行RT-PCR。使用以下引物进行实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析，RAGE：上游：5-CTG GGT GCT GGT TGC T-3’，下游：5-TCC CTC GCC TGT TAG TTG C-3’；PPAR-γ：上游：5’- TTT TCA AGG gtca GTT TC-3’，下游：5’- ggc TTC CGC AGG CTT -3’。b-Actin用于内部控制。b-Actin的引物为：上游：5’-GCT GTC CCT GTA TGC CTC TG-3’，下游：5’-TGT CAC GCA CGA TTT CCC T-3’。扩增后，通过20℃/s 95℃加热产物，在20℃/s 55℃冷却，并保持在55℃ 20 s，然后慢慢地加热0.1℃/s到94℃，融化曲线即可获得。比较分析采用2-△△CT法。每个反应一式3份进行。

1.2.4 RAGE及PPAR-γ蛋白的表达 收集细胞，提取总蛋白，取各样本蛋白50 μg进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转移法将蛋白转移至PVDF膜，封闭后分别加入一抗孵育，洗膜后加入HRP 标记的二抗孵育，充分洗涤后加入增强发光剂，即刻与底片曝光，洗片后扫描电泳条带并进行光密度分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 VSMCs的鉴定

HE染色观察可见VSMCs呈梭形生长，核较大，胞质较多，胞浆着粉红色，胞质近中央处有圆形或椭圆形的细胞核，胞核着蓝紫色，细胞密度达到80%～90%融合时，细胞互相平行排列，生长区域呈漩涡状，细胞界限清楚(图1A)。经特异性免疫组织化学SM-α-actin染色，荧光高倍镜下可见胞浆内SM-α-actin表达丰富，细丝状排列，符合VSMCs特征(图1B)。

A：HE染色后小鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养(×200)；B：VSMCs免疫荧光α-SM Actin 阳性表达(×400)图1 小鼠主动脉平滑肌细胞鉴定

2.2 PIO和GW9662对小鼠VSMCs中RAGE和PPAR-γ mRNA表达的影响

与NG组比较，高糖增加小鼠VSMCs中RAGE的mRNA表达(P=0.001，图2A)，但降低小鼠VSMCs中PPAR-γ的mRNA表达(P=0.001，图2B)。PIO可抑制高葡萄糖对VSMCs中RAGE的mRNA影响(P= 0.014)和PPAR-γ的mRNA表达(P= 0.001)。PPAR-γ抑制剂GW9662可抑制PIO对RAGE(P= 0.001)和PPAR-γ(P= 0.002)的mRNA表达的影响。单用GW9662不影响高糖环境中RAGE(P= 0.946)和PPAR-γ(P= 0.964)的mRNA表达，见图2。

A：RT-PCR分析显示VSMCs中RAGE的mRNA表达；B：RT-PCR分析显示VSMCs中PPRA-γ的mRNA表达；NG：正常浓度葡萄糖组；HG：高浓度葡萄糖组；HG+PIO：高浓度葡萄糖+PIO组；HG+PIO+ GW9662：高浓度葡萄糖+PIO+GW9662组；HG+ GW9662：高浓度葡萄糖+GW9662组；aP<0.05图2 PIO和GW9662对小鼠VSMCs中RAGE和PPAR-γ的mRNA表达的影响

2.3 PIO和GW9662对小鼠VSMCs中RAGE和PPAR-γ蛋白表达的影响

高浓度葡萄糖增加RAGE(P=0.002)，但减少PPAR-γ蛋白(P=0.001)表达；而PIO可部分逆转高浓度葡萄糖对RAGE(P=0.006)和PPAR-γ(P=0.008)蛋白表达的影响。此外，GW9662抑制PIO对RAGE(P=0.004)和PPAR-γ(P=0.012)蛋白表达的影响，见图3。

A：VSMCs中RAGE和PPAR-γ的蛋白印迹图像；B：定量分析VSMCs中RAGE的蛋白表达；C：定量分析VSMCs中PPAR-γ的蛋白表达；aP<0.05图3 PIO和GW9662对小鼠VSMCs中RAGE和PPAR-γ蛋白表达的影响

3 讨论

本研究发现，PIO抑制高糖诱导的小鼠主动脉VSMCs的RAGE蛋白质和mRNA的表达；应用PPAR-γ特异性抑制剂GW9662能明显抑制PIO对高糖诱导的小鼠主动脉VSMCs中RAGE表达的影响。

糖尿病加重动脉粥样硬化进展，导致糖尿病大血管并发症的发生。研究表明，RAGE在糖尿病加速的动脉粥样硬化中起着至关重要的作用[1]。Sun等[2]发现，RAGE和低密度脂蛋白受体(LDLR)双基因敲除小鼠较LDLR单基因敲除小鼠的动脉粥样斑块损伤面积缩小、巨噬细胞聚集减轻，细胞间粘附分子1(ICAM-1)及血管细胞粘附分子1(VCAM-1)在主动脉中的表达均下降，血管壁细胞的氧化应激水平下降。Soro等[3]研究发现，糖尿病RAGE-/-/ApoE-/-双基因敲除小鼠和糖尿病ApoE-/-单基因敲除小鼠相比，动脉粥样硬化斑块的面积明显减少，炎症因子水平及粘附分子包括VCAM-1、MCP-1和NADPH氧化酶的水平显著下降。故RAGE在糖尿病小鼠动脉粥样硬化的过程中发挥了重要的作用。而可溶性RAGE，可结合RAGE 配体，与RAGE 竞争配体，拮抗RAGE 的作用，成为RAGE 的抑制剂。在糖尿病的ApoE-/-基因敲除小鼠模型中，应用sRAGE注射的小鼠动脉粥样硬化斑块的面积和斑块复杂性明显减低，同时减少了炎症因子的表达以及单核巨噬细胞和平滑肌细胞的活性[4]。但是，目前针对可溶性RAGE的实验仅局限在动物实验阶段。

PIO能减轻动脉粥样硬化的发展。最近的动物研究证实了PIO对动脉粥样硬化的保护作用[5]。此外，大规模的临床研究支持PIO对动脉粥样硬化预防和治疗的有益作用[6-7]，但潜在机制仍不清楚。研究显示，PIO作为一种胰岛素增敏剂，在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型的大脑中通过抑制RAGE表达，逆转学习和记忆行为能力的损害[8]。此外，RAGE表达与人肝细胞癌的病理分期和肿瘤侵袭密切相关，PIO通过对RAGE信号的封锁抑制人类肝癌的生长和侵袭[9]。最近的研究发现，PIO通过抑制AGE/RAGE轴的活性改善糖尿病肾损害[10]。另外，PIO对神经的保护作用和PPAR-γ介导的RAGE抑制有关[11]。故RAGE信号可能是PIO治疗的目标。我们的研究表明，PIO在培养的小鼠主动脉VSMCs中减少高糖诱导的RAGE的mRNA和蛋白表达。此外，应用PPAR-γ的特异性抑制剂GW9662可部分减轻PIO对RAGE的mRNA和蛋白表达的抑制作用。因此，PIO抑制RAGE信号可通过PPAR-γ依赖的途径，与既往研究一致。在冠状动脉平滑肌细胞中，PIO可通过激活PPAR-γ，下调RAGE的表达和抑制活性氧的生成及激活NF-κB[12]。另外，单用GW9662并未明显影响高糖环境中RAGE和PPAR-γ mRNA和蛋白的表达，这可能与样本量少有关，也可能有更为复杂的机制参与，需要后续实验证实。

总之，PIO能明显抑制高糖诱导的小鼠主动脉VSMCs的 RAGE表达，其对RAGE表达的有益作用可被PPAR-γ特异性抑制剂GW9662部分消除，可通过激活PPAR-γ抑制RAGE表达，但需要更多研究证实。

利益冲突：无