掺锶生物活性玻璃通过调控巨噬细胞极化促进成骨

张 文，黄德球，郭周义，陈晓峰

(1.华南师范大学 a. 脑科学与康复医学研究院； b.生物光子学研究院, 广东 广州 510631； 2.华南理工大学材料科学与工程学院，广东 广州 510641)

近年来，越来越多的研究表明免疫系统在骨重建过程中起着关键的调控作用[1-3]。免疫系统和骨骼系统密切相关，它们共享许多细胞因子、受体、信号分子和转录因子等。骨修复材料植入宿主体内后即可激发机体产生免疫应答，并可通过调控免疫系统来影响骨缺损的愈合和修复过程。如果材料引发过度的炎症性免疫反应将导致纤维囊的形成，妨碍成骨细胞附着到植入材料上，并最终导致骨修复失败[4]；反之，材料引发的有益炎症反应将增强骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的募集和向成骨分化，促进骨修复[5]。因此，骨修复材料的开发也从以往的免疫“惰性”材料向免疫调节型材料发展，赋予材料有益的骨免疫调节性能，将有利于进一步诱导成骨和骨整合[6]。

在众多的免疫细胞中，巨噬细胞由于具有高度的功能可塑性，常被用作免疫细胞中的模型细胞。巨噬细胞是最重要的免疫细胞，在免疫应答中起着重要作用。在不同的微环境条件刺激下，巨噬细胞可向M1和M2两种不同表型极化并分泌出不同的细胞因子[7-9]。其中M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，不利于成骨分化；而M2型巨噬细胞主要产生抑炎因子，此外，还可通过分泌各种生长因子如骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)-β、血小板衍生生长因子(PDGF)等来调节成骨[10-12]。因此，通过调控巨噬细胞及时地从M1型向M2型的转换将有利于形成有利的成骨免疫微环境，从而进一步促进成骨[13]。

生物活性玻璃(bioactive glasses，BG)由于具有良好的生物相容性，优异的骨修复性能，在骨修复中的应用广泛[14,15]。尤其是近年来微纳米生物活性玻璃(micro/nano bioactive glasses，MNBG)的研发，解决了传统熔融法BG和溶胶-凝胶法BG易于团聚的缺点，并具有更高的比表面积和生物活性，有望于更好地应用于骨修复中[16-20]。BG在植入体内后通常会在降解过程中释放出硅(silicon，Si)，钙(calcium，Ca)和磷(phosphorus，P)等生物活性离子，这些离子在促进成骨分化中具有重要的作用[21]。锶(strontium，Sr)是具有促进成骨和抑制破骨双重作用的一种微量元素[22]，且Sr还具有显著的抗炎作用[23]。为了进一步增强BG的促成骨分化作用，在MNBG中掺入Sr元素制备成新型免疫调控型材料掺锶微纳米生物活性玻璃(strontium-substituted micro/nano bioactive glasses，Sr-MNBG)，可以达到更优的成骨效果。为了验证以上假设，本文制备了不同掺锶量的Sr-MNBG，并通过体内外实验研究了这些材料是否能具有免疫调控作用，并通过免疫调控产生有利的成骨微环境，从而促进成骨。

1 实验

1.1 材料制备

本研究所使用的Sr-MNBG为以十二胺为催化剂和模板剂，结合溶胶凝胶法和模板法制备而成。通过以硝酸锶为Sr来源，以Sr替代MNBG中不同摩尔百分比的Ca，得到掺Sr量分别为0%，5%，10%和15%的Sr-MNBG。具体制备过程参考本课题组前期的文献报道[24]。

1.2 巨噬细胞极化研究

本研究所使用的RAW264.7巨噬细胞和小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)购买自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。不同掺Sr量Sr-MNBG对巨噬细胞极化的影响采用流式细胞仪(Guava Easycyte HT)对M1/M2巨噬细胞表面标记分子进行检测。不同掺Sr量的Sr-MNBG作用于巨噬细胞3 d后，收集细胞培养上清，离心去沉淀后冻于-80 ℃用于后续研究。收集巨噬细胞，清洗重悬后置于冰上，分别与M1型巨噬细胞表面标记分子CD11c，M2型巨噬细胞表面标记分子CD206一抗孵育60 min，离心清洗后与二抗冰上孵育30 min，再次离心清洗后重悬于PBS中上机检测。所得数据使用Guavasoft 2.5软件进行分析。

1.3 巨噬细胞调控液促成骨分化作用研究

mMSCs以5.0×104每孔的密度接种于24孔板，将1.2中所得的巨噬细胞培养上清按照1∶2的比例与DMEM完全培养基混合后加入到mMSCs中，通过培养14 d时的茜素红染色和培养7 d时的实时荧光定量PCR(RT-PCR)研究其对mMSCs成骨分化的影响。

茜素红染色的步骤如下：配制0.5%茜素红染色液，调pH值至4.2。取出待染色的24孔板，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定20 min。染色前用超纯水清洗后加入适量染色液，摇动孵育5 min后用超纯水洗至上清无色，空气中晾干并于倒置显微镜下观察拍照。

RT-PCR的步骤如下：mMSCs的总RNA提取通过美基生物的Hipure Total RNA Kits来完成。使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser将总RNA逆转录成cDNA，最后使用Thermo公司的Maxima SYBR Green试剂盒在10 μL体系下进行RT-PCR操作检测成骨相关基因表达。通过2-△△CT法，以GAPDH为看家基因计算细胞中基因表达的相对水平。本研究所用引物如表1所示。RT-PCR和细胞实验均重复三次，使用SPSS Statistics version 22(IBM, USA)统计软件进行数据分析，ANOVA及LSD检验进行组间比较，P值<0.05 表示统计学差异具有显著性。

1.4 原位骨缺损修复实验研究

实验所需SD大鼠购自广东药科大学动物实验中心，分为4组，每组8只。戊巴比妥纳麻醉后，常规消毒腿部皮肤，用手术刀在大腿内侧做一个1 cm的切口，分离皮下组织和肌腱，暴露股骨内侧髁。使用电动牙科钻在股骨内侧髁钻一个直径为3 mm，深3 mm的圆柱形孔。填入不同掺Sr量的Sr-MNBG后缝合肌肉和皮肤，并于术后三天使用红霉素软膏，防止伤口感染。分别于术后7天和28天处死大鼠，取股骨，用10% EDTA脱钙处理30 d后，包埋切片，进行免疫组化染色和Masson染色。免疫组化染色中使用iNOS表征M1型巨噬细胞，精氨酸酶表征M2型巨噬细胞。

表1 本研究中RT- qPCR 的引物设计Tab.1 Primer design used in the RT-qPCR

2 实验结果与讨论

2.1 不同掺Sr量Sr-MNBG对巨噬细胞极化的影响

图1是流式细胞仪检测RAW264.7巨噬细胞分别在0%Sr-MNBG、5%Sr-MNBG、10%Sr-MNBG和15%Sr-MNBG作用后表面标记分子表达情况，其中M1型巨噬细胞的表面标记分子为CD11c，M2型巨噬细胞的表面标记分子为CD206。从图中可以看出，与0%Sr-MNBG相比，巨噬细胞在5%Sr-MNBG、10%Sr-MNBG和15%Sr-MNBG的作用下，其细胞膜表面均表达更少的M1表面标记分子CD11c，表达更多的M2表面标记分子CD206，此结果表明掺入Sr可以促进MNBG调控巨噬细胞向M2极化的作用，且10%Sr-MNBG具有最佳的作用效果。这可能与Sr的掺入量有关，过低的掺锶量不足以达到促进巨噬细胞M2极化的作用，而过高的掺锶量也可能导致巨噬细胞向M2极化的能力受限。因此，适宜的掺锶量才能够调控最佳的巨噬细胞M2极化效果。

2.2 Sr-MNBG调控的巨噬细胞分泌成分对mMSCs成骨分化的影响

将0%Sr-MNBG、5%Sr-MNBG、10%Sr-MNBG和15%Sr-MNBG调控巨噬细胞条件培养液用于mMSCs的培养，研究材料调控的巨噬细胞分泌成分对成骨分化的影响。各组的条件培养液与mMSCs共培养14 d后，进行茜素红染色，结果如图2所示，与0%Sr-MNBG组相比，其他组均有更多的矿化结节形成，其中10%Sr-MNBG组形成的矿化结果最多。此外，mMSCs与各组的条件培养液共培养7 d后，其成骨分化基因的表达结果如图3所示。与0%Sr-MNBG组相比，5%Sr-MNBG、10%Sr-MNBG和15%Sr-MNBG的成骨分化基因表达均有不同程度表达上调，且具有显著性差异。上调程度10%Sr-MNBG组>15%Sr-MNBG组>5%Sr-MNBG组>0%Sr-MNBG组。结合茜素红染色和基因表达的结果来看，不同掺锶量的Sr-MNBG诱导的巨噬细胞极化后所分泌的因子均可一定程度促进成骨分化，且10%Sr-MNBG组诱导的巨噬细胞分泌成分具有最好的促成骨效果。

图1 巨噬细胞在不同掺锶量Sr-MNBG作用下的流式细胞结果Fig.1 Flow cytometry results of macrophage stimulated by Sr-MNBG)with 0, 5%, 10% and 15% molar percent of strontium element

图2 巨噬细胞条件培养液与mMSCs共培养14 d后的茜素红染色结果(所有标尺均为200 μm)Fig.2 Alizarin red S staining of mMSCs with macrophage-conditioned medium for 14 days (scale bar is 200 μm)

图3 巨噬细胞条件培养液与mMSCs共培养7 d后的成骨分化基因表达(*P<0.05与0%Sr-MNBG组比较；#P<0.05与5%Sr-MNBG组比较；@P<0.05与10%Sr-MNBG组比较)Fig.3 Fold change of osteogenesis gene expression of mMSCs with macrophage-conditioned medium for 7 days (*P<0.05 vs 0%Sr-MNBG group;#P<0.05 vs 5%Sr-MNBG group;@P<0.05 vs 10%Sr-MNBG group)

2.3 原位骨缺损修复实验验证巨噬细胞极化和成骨作用

图4和图5为对骨缺损处组织进行免疫组化染色的结果，其中图4为M1型巨噬细胞标记分子iNOS的表达情况，图5为M2型巨噬细胞标记分子精氨酸酶的表达情况。从图4中可看出，0%Sr-MNBG组骨缺损周围M1型巨噬细胞浸润最多，而10%Sr-MNBG组M1型巨噬细胞浸润最少。从图5中可以看出M2型巨噬细胞标记分子的表达呈现出与M1型巨噬细胞相反的趋势，即0%Sr-MNBG组具有最少的M2巨噬细胞浸润，10%Sr-MNBG具有最多的M2巨噬细胞浸润。这些结果说明掺锶的Sr-MNBG的植入能够促进巨噬细胞向M2极化，其中10%Sr-MNBG具有最佳的促巨噬细胞M2极化作用，与体外细胞实验结果相符。

图4 巨噬细胞M1极化标记分子winos免疫组化染色(所有标尺均为200 μm)Fig.4 Immunohistochemical staining of M1 macrophage marker iNOS (scale bar is 200 μm)

图6 Sr-MNBG植入28天后骨缺损处的Masson染色(所有标尺均为200 μm)Fig.6 Masson staining of bone defect after the implantation of Sr-MNBG for 28 days (scale bar is 200 μm)

通过对不同掺锶量Sr-MNBG植入体内后28天的骨修复效果进行Masson染色检测，结果如图6所示：10%Sr-MNBG组形成了更多的新生骨，表现出更好的成骨效果，与体外细胞实验相一致。

3 总结

本文制备了0%，5%，10%和15%的锶掺杂微纳米生物活性玻璃，并通过体内外实验研究了不同掺锶量的Sr-MNBG对巨噬细胞极化的影响及其极化后的巨噬细胞对成骨分化的影响。体内外研究的结果均显示不同掺锶量的Sr-MNBG均具有促进巨噬细胞向M2极化的作用，且巨噬细胞M2极化后的分泌因子可进一步促进成骨分化，其中10%掺锶量的MNBG具有最好的促巨噬细胞M2极化效果。我们在以往的研究中也证明了掺锶的亚微米生物活性玻璃能够通过促进巨噬细胞适度的M2极化来进一步诱导成骨[24]，但是尚未对锶的掺杂量进行优化，本研究制备了一系列不同锶掺杂量的MNBG，通过比较分析不同掺锶量MNBG对巨噬细胞极化的作用，得出了诱导巨噬细胞M2极化的最佳锶掺杂量。以往对掺锶磷酸钙影响炎症因子分泌的研究中发现锶元素在高浓度和低浓度时均能抑制促炎因子TNFα的分泌，而对炎症因子IL6的分泌具有浓度依赖的抑制作用，高浓度时促进IL6的分泌，低浓度时抑制IL6的分泌[25]。本研究的结果也表明了锶元素的掺杂量并非越高越好，适度的锶元素掺杂更能诱导最佳的成骨免疫微环境。通过本研究，我们进一步证实了巨噬细胞极化在骨修复进程中所发挥的重要作用，通过对材料进行组分调整，也可作用一种调控免疫反应的良好策略。经过优化的适宜掺锶量的Sr-MNBG也有望作为一种具有有益骨免疫调控功能的骨修复材料应用于骨修复。