肥胖对小鼠肝脏GDF-15、TMPRSS6、Hepcidin表达的影响

王 辰,李 蔓,张万山,魏守刚

(首都医科大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学系,北京 100069;*通讯作者,E-mail:shangwei@ccmu.edu.cn)

近年有研究显示,超重并肥胖妇女的铁吸收率是正常体质量妇女的2/3[1],超重、肥胖儿童铁缺乏症发生率高于正常体质量儿童,缺铁性贫血发生率明显增高[2]。肥胖与缺铁显著相关[3],机体内铁调素(hepcidin)含量增加是肥胖儿童铁吸收降低的主要原因[4,5]。关于机体铁调节机制的最新研究发现,主要由肝脏合成和分泌的小蛋白分子铁调素,可以结合肠铁转运蛋白并使其内化和降解,阻碍细胞内的铁释放入血从而实现对铁的调控,是调节铁稳态的关键物质[6,7]。而在影响铁调素表达的调控因子中,生长分化因子-15(growth differentiation factor-15,GDF-15)被发现有抑制其表达的作用[8],跨膜丝氨酸蛋白酶6(transmembrane serine protease 6,TMPRSS6)的过度表达也可以明显抑制铁调素基因表达[9]。那么是否可以推测,肥胖状态可以通过影响GDF-15或TMPRSS6的表达,实现对铁调素的调节,进而影响机体铁吸收。因此,本实验选取对高脂饮食较为敏感的C57BL/6J小鼠。建立与人类肥胖最为接近的,高脂饲料诱导的单纯性肥胖小鼠模型,及普通饲料喂养的正常体质量对照组。观察GDF-15、TMPRSS6、hepcidin及肝脏和血液中57Fe在肥胖模型组及对照组的变化情况。进一步从分子机制层面探索肥胖机体铁调节机制,为肥胖性铁缺乏的治疗及预防提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)、DNase 1、5X RNA Loading Buffer购于北京康为世纪生物科技有限公司;GDF-15、TMPRSS6抗体购于英国Abcam公司;Goat anti Rabbit IgG抗体购于美国Thermo公司;DBA试剂盒购于上海斯信生物科技有限公司;70%HNO3(BV-Ⅲ级)、30%H2O2(Mos级)购于北京化学试剂研究所;Fe单元素标准物质(1.000 g/L)购于国家标准物质研究中心。

1.2 实验动物及处理

由军事医学科学院实验动物中心提供[SCXK(军)2014-0004]4-6周龄雄性C57BL/6J小鼠20只,SPF级,体质量10-15 g。随机分为肥胖模型组和对照组,每组10只。对照组饲喂SPF级辐照灭菌基础饲料:70%碳水化合物、20%蛋白质、10%脂肪;肥胖模型组饲喂配比为:猪油10%、基础饲料79%、蛋黄粉10%、胆固醇1%的SPF级辐照灭菌高脂饲料。两组小鼠每周称重1次,共饲养15周。建模成功后,将小鼠麻醉、固定、消毒并进行心脏采血。然后实施手术纵切口暴露腹腔,迅速取出肝脏,用生理盐水冲洗干净,放入冻存管置于液氮中保存,随后将样本转入-80 ℃冰箱以备进行后续检测。

1.3 real-time PCR法检测肝脏hepcidin mRNA

取冻存组织，用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA，之后取5 μl RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，以检测RNA的完整性。用DNaseⅠ试剂盒对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理。消化后的RNA用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，反应结束后的cDNA放置-20 ℃保存。用UltraSYBR Mixture(With ROX)对反应体系进行扩增，内参基因(β-actin)及目的基因(hepcidin)引物序列(见表1)，扩增程序为：95 ℃预变性10 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)×45个循环，每个样本同时做3个重复。用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据的相对定量。

表1 β-actin及hepcidin引物序列Table 1 β-actin and hepcidin sequences of the primers

1.4 免疫组化法测定肝脏GDF-15、TMPRSS6的相对表达量

取组织石蜡切片置于60 ℃烘箱烘片。取出切片，用二甲苯及梯度乙醇将组织脱蜡至水。以柠檬酸盐(pH6.0)对组织进行抗原修复，再将切片放入底部有少量双蒸水的孵育盒中孵育。孵育后用PBST洗涤切片，并浸入3%H2O2进行封闭。封闭后加入浓度为10%的上样血清，37 ℃封闭1 h，实现血清封闭。封闭结束后用3%山羊血清按1 ∶300的比例稀释GDF-15及TMPRSS6抗体进行一抗孵育、再按1 ∶300比例稀释Goat anti Rabbit IgG进行二抗孵育及DAB显色。显色后，在片子上滴加100 μl的苏木素完成核染，然后对切片进行分色、脱水、透明、烘干及拍照曝光。

1.5 ICP-MS法测定小鼠血液57Fe相对含量

精确吸取Fe单元素的标准溶液,用5% HNO3逐级稀释,然后称重并摇匀,配置标准溶液并计算浓度。准确称取肝样品0.2-0.35 g,加入70% HNO31.0 ml、30% H2O20.5 ml,置于微波消解炉PFA内罐中加热消解。待温度降至低于60 ℃后取出消解罐，在通风橱内将样品转移至样品瓶中，用纯水洗涤PFA罐，且一并将洗液转移至样品瓶中，定容至8 ml。冷冻血样品在4 ℃冰箱过夜，常温放置2 h，震荡混匀30 s；取离心管，用移液枪吸取样品0.2 ml加入其中，再加入HNO3及内标溶液，水浴消解至溶液透明，定容至10 ml，待测。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 肥胖小鼠模型建立结果

依据肥胖度公式,肥胖度(%)=(模型组实际体质量-对照组平均体质量)/对照组平均体质量×100%,以高脂饲料肥胖模型组每只小鼠体质量都高于正常对照组小鼠平均体质量20%,判断建模成功。本实验完成15周的饮食干预后,高脂饲料肥胖模型组小鼠的平均体质量为34.08±1.28 g,正常对照组小鼠平均体质量为24.50 g±0.85 g,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。且肥胖模型组每只小鼠肥胖度均>20%,肥胖模型建模成功。

2.2 肥胖对肝脏hepcidin mRNA表达的影响

与对照组相比较,肥胖模型组小鼠肝脏hepcidin mRNA表达量增多(0.282±0.109vs0.494±0.139,P<0.01,见图1)。

2.3 肥胖对肝脏中GDF-15表达的影响

IHC检测结果显示,与对照组相比较,肥胖模型组小鼠肝脏GDF-15表达减少(0.097±0.005vs0.035±0.006,P<0.01,见图2)。

2.4 肥胖对肝脏中TMPRSS6表达量的影响

IHC检测结果显示,与对照组相比较,肥胖模型组小鼠肝脏TMPRSS6表达无显著改变(0.068±0.009vs0.085 3±0.027,P>0.05,见图3)。

表2 两组小鼠各周平均体质量结果 (g)Table 2 Body weight in obesity model group and control group at different time points (g)

与对照组相比,*P<0.05

与对照组比较,**P<0.01图1 肥胖模型小鼠与对照小鼠肝组织hepcidin mRNA的表达Figure 1 Expression of hepcidin mRNA in obese model mice and normal control mice liver

图2 肥胖模型小鼠与对照小鼠肝组织GDF-15的表达Figure 2 Expression of GDF-15 in liver tissues of obese model mice and normal control mice与对照组比较,**P<0.01

图3 肥胖模型小鼠与对照小鼠肝组织TMPRSS6的表达Figure 3 Expression of TMPRSS6 in liver tissues of obese model mice and normal control mice

2.5 肥胖对血液及肝脏中57Fe含量的影响

ICP-MS检测结果显示,与对照组相比较,肥胖模型组小鼠血液57Fe含量减少[(22.970±4.492)μg/mlvs(15.647±1.629)μg/ml,P<0.05];肝脏57Fe含量减少[(603.103±35.511)μg/gvs(226.073±12.124)μg/mg,P<0.05,见图4]。

与对照组比较,*P<0.05图4 肥胖模型小鼠与对照小鼠血液及肝组织57Fe的相对表达Figure 4 The relative expression of 57Fe in blood and liver tissues of obese model mice and control mice

3 讨论

超重和肥胖会导致高血压、冠心病等慢性疾病,也会严重影响少年儿童生殖系统及心理健康的发育,是危害儿童及青少年健康的重要因素之一。缺铁性贫血不仅可以引起机体胃肠道及免疫功能失调等多种内分泌代谢紊乱,对少年儿童智能及行为发育的损害更是不容忽视。在以往的研究中,缺铁多是由膳食造成的营养不良导致,但近年来,国内外有不少研究发现,超重及肥胖儿童青少年缺铁性贫血的发生率高于正常体质量儿童。例如在以色列一项研究中,肥胖患儿的铁缺乏率高达38.8%,而正常体质量组儿童铁缺乏率仅为4.4%[10]。墨西哥及欧洲一些国家的研究显示,肥胖儿童体内铁贮存减少(ID)及患缺铁性贫血(IDA)的危险性是正常体质量儿童的2-4倍[11-13]。我国也有资料显示,3-5岁儿童、6-17岁学龄儿童至青少年的低铁贮存率随着体质指数的增加而不断上升[14]。但进一步研究发现,肥胖性铁缺乏的儿童并没有表现出对铁的过度需求[10],并且使用铁强化食物对此类儿童进行饮食干预后,铁缺乏改善收效甚微[15]。以上研究启示,造成肥胖儿童铁缺乏的重要因素,可能是体内铁吸收率降低。已有很多研究表明,主要由肝脏分泌的小分子多肽铁调素(hepcidin),可以直接与十二指肠黏膜上皮细胞表面的膜铁转运蛋白FPN1结合,导致FPN1表达降低、内化甚至降解。hepcidin表达水平升高,加速FPN1的降解,抑制铁经黏膜细胞释放至血液循环[16];hepcidin水平降低,可以重新使膜铁转运蛋白将细胞内铁转运至血液中,以此实现对铁吸收的调节,进而维持机体铁平衡。然而单纯性肥胖机体中hepcidin表达会发生何种变化,已有实验观观察到高脂饮食动物模型肝脏hepcidin表达高于低脂饮食模型[17]。本研究检测结果显示,与正常对照组相比较,肥胖模型组小鼠肝脏hepcidin表达增加(P<0.01),证明肥胖可以显著上调肝脏hepcidin的表达。且相较于对照组而言,模型组小鼠肝脏及血液57Fe表达均显著降低(P<0.05),提示肥胖机体中可能同样存在hepcidin高表达抑制肠铁释放入血,从而造成机体血循环铁减少的铁调节机制。

生长分化因子-15(GDF-15)为转化生长因子-beta(TGF-beta)超家族的成员[18]。有研究发现,GDF-15在先天性红细胞生成障碍性贫血患者体内显著增高,高水平的GDF-15可以抑制hepcidin表达[19]。且丙酮酸激酶缺乏症(PKD)患者体内的hepcidin,可以被GDF-15所抑制[20]。至此,可以认为GDF-15具有抑制hepcidin的作用。本研究观察到,肥胖模型组小鼠GDF-15的表达量远低于对照组小鼠,说明肥胖抑制了GDF-15的表达。并且由于模型组小鼠hepcidin表达量远多于对照组小鼠,推测肥胖可能通过降低GDF-15的表达解除了对hepcidin的抑制,使hepcidin表达增多。

跨膜丝氨酸蛋白酶6(TMPRSS6),是Ⅱ型跨膜型丝氨酸蛋白激酶家族的新成员,特异性高表达于肝脏[21]。它可以通过竞争性结合膜型铁调素调节蛋白(mHJV),抑制骨形态发生蛋白信号转导通路HJV-BMP/SMAD的激活,从而抑制hepcidin的基因表达[22]。本实验中TMPRSS6在两组小鼠肝脏中的表达量没有显著差异(P>0.05),而肥胖模型组小鼠肝脏hepcidin表达明显多于对照组小鼠。故不能认为肥胖能够引起TMPRSS6表达量的改变,并由此影响BMP/SMAD信号通路,造成hepcidin的不同表达。

综上所述,肥胖机体铁缺乏的状态还不能认为与TMPRSS6的表达量相关。但肥胖可以降低hepcidin负向调节因子GDF-15的表达,并可由此引发肝脏hepcidin过表达,抑制铁从肠细胞内输送至血液,造成机体铁吸收障碍。