山西吕梁市产ESBL大肠埃希菌基因型和耐药性分析

陈利荣,贾艳梅,王亚鹏,任天琪,车昌燕,李晋华

(1山西医科大学汾阳学院医学检验系生物学教研室,汾阳 032200;2山西医科大学汾阳学院医学检验系生物化学教研室;3山西医科大学汾阳学院医学检验系病原微生物与免疫学教研室;4山西医科大学附属汾阳医院检验科;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:clr928@163.com)

超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase, ESBL)是丝氨酸蛋白酶的衍生物,能够水解青霉素、广谱及超广谱头孢菌素及单环β-内酰胺酶抗菌药物[1],主要由肠杆菌科中的大肠埃希菌产生[2]。由于ESBL由质粒介导,可以通过多种方式在细菌间传递,所以ESBL的产生是导致细菌对多种抗菌药物耐药的重要机制之一。大肠埃希菌是医院感染的常见病原菌,近年来产ESBL大肠埃希菌感染的报道呈持续上升趋势[3]。但目前关于吕梁地区产ESBL大肠埃希菌的基因型和耐药性尚未见报道,所以了解吕梁地区产ESBL大肠埃希菌的基因型分布并分析其对临床常用抗菌药物的耐药性,可以为临床合理有效地使用抗菌药物、控制耐药菌株的播散和流行提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2014-01～2015-10山西省吕梁市汾阳医院从患者痰液、尿液等分泌物中分离的大肠埃希菌87株,同一患者不重复留取。大肠埃希菌质控菌株ATCC25922和ATCC35218购于国家临床检验中心。

1.1.2 抗菌药物及试剂 药敏纸片(头孢曲松、头孢噻肟、氨曲南、头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸)购自北京天坛药物生物技术开发公司,M-H培养基购自英国OXOID公司。LB培养基、质粒提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、10×Buffer缓冲液、dNTP及DNA marker购自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 产ESBL大肠埃希菌的鉴定 采用ATB细菌鉴定仪从临床标本中分离出的细菌进行鉴定,筛选出大肠埃希菌。将经鉴定的大肠埃希菌配制成0.5麦氏浊度的菌悬液,均匀涂布在M-H平板上,并将药敏纸片头孢噻肟(30 μg)和头孢噻肟/克拉维酸(10 μg)、头孢他啶(30 μg)和头孢他啶(30 μg)/克拉维酸(10 μg)均匀贴于M-H平板上,35 ℃左右培养18-24 h后,测量抑菌环直径,两对纸片中只要其中一对纸片加克拉维酸者比不加克拉维酸者的抑菌环直径≥5 mm时,即确证为产ESBL菌株。

1.2.2 产ESBL大肠埃希菌基因型分析 根据GenBank中登录的各型ESBL基因序列设计3对引物(见表1),由北京赛百盛基因技术有限公司合成。对证实产ESBL的菌株,常规试剂盒提取细菌质粒DNA作为模板进行扩增,PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定ESBL基因型。

表1 各组ESBL引物序列和扩增片段长度Table 1 ESBL primer sequences and amplified fragment length

1.2.3 大肠埃希菌的抗菌药物敏感试验 采用ATB细菌药敏分析仪进行细菌药敏试验,结果评价按照2014年美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)推荐的判读标准进行判断。

2 结果

2.1 筛选并鉴定出42株产ESBL大肠埃希菌

共收集大肠埃希菌87株,经初筛试验和确证试验检出42株产ESBL大肠埃希菌(见图1),阳性率为48.3%。

图1 ESBL表型确证试验阳性结果Figure 1 The positive result of ESBL phenotype confirmation test

2.2 产ESBL大肠埃希菌耐药基因型的分布情况

42株产ESBL大肠埃希菌均可扩增出ESBL基因,含耐药基因CTX型10株,TEM型4株,SHV型1株,同时含两种及两种以上基因型达27株,各基因型分布见表2,琼脂糖凝胶电泳结果见图2。

表2 产ESBL大肠埃希菌基因型分布Table 2 Genotype distribution of ESBL-producing E.coli

M.Marker;1-2.CTX型;3-4.SHV型;5-6.TEM型图2 产ESBL大肠埃希菌PCR扩增结果Figure 2 PCR amplification results of E.col producing ESBL

2.3 分离出的大肠埃希菌的抗菌药物敏感试验结果

药敏结果显示42株产ESBL大肠埃希菌对阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、头孢噻吩、头孢他啶和头孢呋辛全部耐药,对左氧氟沙星、头孢西丁、头孢噻肟、头孢吡肟、复方新诺明、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、替奈米星和环丙沙星的耐药率明显高于非产ESBL大肠埃希菌,对美洛培南和亚胺培南则全部敏感(见表3)。

表3 大肠埃希菌87株对18种抗菌药物的耐药性分析Table 3 Resistance analysis of 87 strains of E.coli to 18 kinds of antimicrobial agents

3 讨论

大肠埃希菌是人体的正常菌群,广泛存在于自然界和人体肠道,当人体免疫力降低或菌群失调时可成为条件致病菌,引起感染性疾病发生,是目前医院感染最常见的病原菌之一[4]。目前临床上广谱抗菌药物,特别是三代头孢菌素的广泛使用,导致新的耐药菌株不断出现,其中产ESBL是大肠埃希菌对β-内酰胺酶类抗菌药物耐药的重要机制[3]。

ESBL能水解几乎所有β-内酰胺酶类和单酰胺类抗菌药物,由质粒介导并能通过结合、转导、转化等方式在细菌间转移和播散[5],造成严重的医院感染并给临床治疗带来极大的困难。近年来医院感染产ESBL的大肠埃希菌的检出率逐年升高[3]。

本研究结果显示吕梁地区临床分离的87株大肠埃希菌中42株产ESBL,检出率高达48.3%。ESBL的主要型别有TEM、SHV和CTX型,细菌对抗菌药物的耐药本质上发生于基因水平,所以分析抗性基因对阐明细菌的耐药机制有重要意义。产ESBL细菌呈世界性流行,但不同地区流行的基因型不同[6],本研究中的42株产ESBL大肠埃希菌的ESBL主要为CTX+TEM双基因型(占52.38%),其次为CTX型(占23.81%)和TEM型(占9.52%)。不同类型的ESBL具有不同的底物水解谱,同时携带CTX和TEM型两种β-内酰胺酶基因,产生两种酶不仅增加了ESBL的产量,同时也拓宽了水解底物的范围,从而增加了细菌的耐药性并拓宽了其耐药谱[7]。本研究的药敏结果显示,产ESBL大肠埃希菌和非产ESBL大肠埃希菌对碳青霉烯类的美洛培南和亚胺培南均无耐药,敏感率为100%,与国内有关报道相一致[8-11];除外美洛培南和亚胺培南,产ESBL大肠埃希菌对常用16种抗菌药的耐药率均高于非产ESBL大肠埃希菌。产ESBL大肠埃希菌相对较敏感的抗菌药物有头霉素类的头孢西丁和氨基糖苷类的阿米卡星,提示临床治疗产ESBL大肠埃希菌引起的严重感染时可首选美洛培南和亚胺培南进行治疗,头孢西丁可作为次选药物,也可以与阿米卡星联合治疗。

本研究比较了山西吕梁地区ESBL阳性和阴性大肠埃希菌的耐药性,并分析了产ESBL菌株的相应基因型。产ESBL大肠埃希菌由于耐药性高且对多种抗菌药物均可产生耐药性,容易引起感染甚至暴发流行,应引起临床上的高度重视,尤其是携带多种基因型的情况。加强对产ESBL大肠埃希菌的检测与监测,对于已发生的感染应尽早给予相应的隔离措施并采取合理有效的治疗方案,防止和减缓细菌耐药性的产生。