柚叶总多酚对LPS所致Caco-2细胞间高通透性的保护作用

宋家乐，陈聪，黄柳燕，曾榛,3，高扬，吴华

（1.桂林医学院公共卫生学院，广西桂林 541100）（2.东南大学公共卫生学院，江苏南京 210009）（3.广西高校预防医学重点实验室，广西桂林 541100）（4.扬州大学附属苏北人民医院药学部，江苏扬州 225001）

肠黏膜屏障是由肠黏膜上皮结构所构成的机械屏障，肠黏膜组织分泌的黏液和消化液所构成的化学屏障，由肠道固有微生物菌落所构成的生物屏障及主要肠道组织中免疫系统与其所分泌的免疫物质构成的免疫屏障等所构成的具有维持肠内环境稳定功能，阻隔外源性有害物质进入血液循环系统的生物结构[1]。肠黏膜屏障功能的异常是导致炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，肠应激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)及肠道肿瘤发生的重要原因[2]。肠上皮细胞和细胞间紧密连接所构成肠上皮结构在防止病原微生物入侵，细菌移位等方面具有重大意义[3]。临床IBD患者肠上皮组织中的细胞间紧密连接结构遭受破坏，上皮细胞通透性增大，肠黏膜屏障损毁严重[4]。因此，改善肠上皮功能，维持细胞间紧密结构完整则有助于改善IBD的临床症状[5]。

柚子(Citrus maximaMerr.)是我国广大南方地区栽培面积和产量较高的经济水果之一，属芸香科柑橘属作物。研究发现，作为加工副产物的柚叶中含有丰富的多酚与黄酮类物质[6,7]，是一种具有较好开发利用度的农业资源废弃物。近年来，多酚和黄酮类植物活性成分因其具抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老和免疫调节等多种生物学功能而越来越成为可持续性农业和生物综合利用研究和开发利用的重点[8]。

目前，柚叶总多酚提取物对于肠道上皮细胞高通透性保护作用的研究鲜见报道。人结肠癌Caco-2细胞是一株具有与正常小肠上皮细胞类似的紧密连接、微绒毛等结构而被公认用于肠道屏障损伤与修复机制研究的经典细胞系[9]。因此，本实验通过利用LPS处理Caco-2肠上皮细胞制备细胞高通透性模型，研究柚叶总多酚对细胞高通透性的保护效果并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM高糖型细胞培养液、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶-EDTA 消化液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，美国 Thermo Scientific公司；Trizol试剂、OligodT18、RNase、dNTP、MLV 逆转录酶，美国Invitrogen公司；ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II，日本 TAKARA 公司；异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐(FD40，分子量 40000 u)、大肠杆菌脂多糖(LPS)，美国Sigma-Aldrich公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒，南京建成生物工程研究所；IL-1β、IL-8、TNF-α试剂盒，美国Cloud colon公司。其他化学试剂均为国产分析纯。新鲜柚叶采自广西壮族自治区平乐县龙窝果园，并经桂林医学院药学院生药学教研室鉴定。

1.2 仪器与设备

EYELA N-1001S真空旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社；GR300型超声波清洗机，山东国锐超声机械有限公司；Biotek Elx808酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；ND2000超微量核酸蛋白测定仪、3110型二氧化碳细胞培养箱，美国 Thermo Scientific公司；AL204电子分析天平，梅特勒-托利多公司上海有限公司；电热恒温水浴锅 HWS-28，上海一恒科学仪器有限公司；FLUOstar OPTIMA荧光酶标仪，德国BMG公司；MERS00002 Millicell-ERS上皮跨膜细胞电阻仪，美国Millipore公司。

1.3 柚叶总多酚提取物的制备

新鲜柚叶双蒸水冲洗除杂后，真空冷冻干燥。冻干柚叶经粉碎后过60目筛备用。取柚叶粉(10 g)加入250 mL乙醇(60%，V/V)后在63 ℃条件下超声提取28 min(超声功率245 W)[6]。滤液经3000 r/min离心15 min后弃渣收集上清，50 ℃真空减压旋转蒸发后，制成柚叶总多酚提取物(收率为30.54%)，-80 ℃储存待用。

1.4 细胞培养与分组

Caco-2人结肠腺癌细胞系(源自中国科学院上海细胞资源中心)由桂林医学院生物技术学院邹先琼教授馈赠。细胞用DMEM培养液(含10%FBS与1%青-链霉素双抗液)置于37 ℃、5% CO2环境下湿化培养。细胞贴壁长至80%时，胰蛋白酶-EDTA液按比例消化传代，取指数期细胞用于实验。

以DMEM 培养液(含LPS：2 μg/mL)处理细胞24 h制备细胞模型。模型细胞以柚叶总多酚提取物(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL)继续培养24 h并进行后续实验。正常组为未经过任何处理的正常Caco-2细胞。

1.5 MTT法测定细胞存活率及LDH脱氢酶水平

细胞按前述分组处理后，移除内培养基(用于后续LDH酶活性测定)并加入100 μL的MTT试剂(终质量浓度：0.5 mg/mL)继续培养24 h。培养结束后弃上清液，每孔加入 DMSO (100 μL)避光振荡 30 min，测定OD490 nm后按公式：细胞生存率(%)＝OD样品组/OD正常组×100来计算细胞生存率。LDH脱氢酶水平采用比色试剂盒按照说明书操作要求进行测定。

1.6 模型细胞中细胞因子 IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平的测定

细胞接种到培养板并依前述方法处理后，4 ℃下收集细胞培养上清液。取适量培养上清液按照IL-1β、IL-8、TNF-α测定试剂盒说明书步骤操作(单位以pg/mL表示)。

1.7 模型细胞的膜通透性水平测定

依前述处理后的细胞接种至Transwell小室中，实验前测定跨上皮细胞电阻(trans epithelial electrical resistance，TEER)检查细胞融合状态和肠上皮屏障的完整性，取细胞屏障完整的细胞(TEER≥100 Ω.cm2)用于实验。移除Transwell小室内外的培养液，HBSS液(pH 7.4)冲洗细胞 3 次，37 ℃孵育30 min 后测量TEER值，待TEER值稳定后记录数据。此外，在Transwell小室顶端腔内加入100 μL的HBSS液(含有终浓度为1 mg/mL的FD-40)，37 ℃孵育2 h，收集侧腔内溶液，使用FLUOstar OPTIMA荧光酶标仪测定荧光强度(激发波长 480 nm，发射波长 530 nm)。

1.8 qRT-PCR 法测定细胞中 IL-1β、IL-8、TNF-α、occludin、claudin-1、ZO-1 和 MLCK的mRNA表达

Trizol试剂盒法提取细胞内总RNA，紫外分光检测提纯后的RNA浓度用于后续实验。取总RNA(2 μg)加入 dNTPs(1 μL)、OligodT18引物(1 μL)、MMLV 逆转录酶(1 μL)、RNases抑制剂(1 μL)及5×Buffer (10 μL)逆转录成cDNA。取适量cDNA (2 μL)用qRT-PCR法检测occludin、claudin-1、ZO-1和MLCK的表达量。在总反应体系中(20 μL)加入上游和下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)、50×ROX reference Dye (0.4 μL)和灭菌双蒸水(5.6 μL)，充分混匀后置于 Quant Studio TM 6 Flex PCR 仪中进行反应。扩增反应条件为 95 ℃ 30 s，95 ℃ 25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，共 40 个循环，72 ℃延伸 5 min。每个基因cDNA样本平行扩增3次，取Ct值均数，依公式计算目的基因表达量[F=2(检测样品中基因的Cr值-检测样品中持家基因的Cr值)/2(空白样品中基因的Cr值-空白样品中持家基因的Cr值)]。

各引物序列如下：IL-1β(上游：5’-GAATGACGCCCTCAATCAAAGT-3’， 下 游 ：5’-TCATCTTGGGCAGTCACATACA-3’)，IL-8 (上游：5’-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3’， 下 游 ：5’-TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3’)， TNF-α(上游 ： 5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’， 下 游 ：5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’)，Occludin(上游：5’-CTTCCAATGGCAAAGTGAATGAATGA-3’， 下游：5’-TACCACCGCTGCTGTAACGAG-3’)，claudin-1 (上游：5’-CCAGGTACGAATTTGGTCAGG-3’，下游：5’-TGGTGTTGGGTAAGAGGTTGT-3’)，ZO-1(上游：5’-GAGCCTAATCTGACCTATGAACC-3’， 下 游 ：5’-TGAGGACTCGTATCTGTATGTGG-3’)，MLCK(上游：5’-CAACAGGGTCACCAACCAGC-3’，下游：5’-GCCTTGCAGGTGTACTTGGC-3’)，GAPDH(上游：5’-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3’， 下 游 ：5’-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3’)。

1.9 数据处理与统计分析

本研究中，所有实验均重复 3次，结果以均值(means)±标准偏差(SD)表示。所有实验数据运用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析与统计处理，p＜0.05为具有统计差异。

2 结果与讨论

2.1 柚叶总多酚提取物对LPS所致Caco-2细胞生存率和细胞LDH释放水平的影响

如表1示，Caco-2细胞在经LPS(2 μg/mL)处理后细胞的生存率较正常组细胞相比下降至43.44%。给予不同浓度的柚叶总多酚提取物处理后，受损细胞的生存率显著升高。

随着柚叶总多酚提取物作用浓度的增加，受损细胞的生存率逐渐升高并呈显著的剂量效应关系(p＜0.05)。特别是在经加高浓度(100 μg/mL 和 150 μg/mL)的柚叶总多酚提取物处理后，模式细胞的生存率分别升高至80.6%和86.1%，生存率分别较未经处理的模型细胞生存率增高1.86倍和1.98倍。

LDH是一种在正常生理情况下稳定存在于细胞内部的功能酶。当细胞遭受外界强烈的应激刺激导致细胞膜损伤后，LDH能够直接从细胞内部溢出。因此，LDH被常用于作为一种有效的生物指标来评估细胞损伤发生程度[10]。与正常组细胞相比，LPS模型组细胞中LDH的溢出量为正常组细胞的4.27倍。经柚叶总多酚提取物处理模型细胞后，细胞 LDH的外溢水平显著降低，且抑制效果存在显著的剂量效应关系(p＜0.05)。较高浓度的柚叶总多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)处理后的细胞中LDH溢出水平分别较未经处理的模型细胞 LDH溢出水平降低 39.2%和42.9%。

表1 柚叶总多酚提取物对LPS所致Caco-2细胞生存率和细胞LDH释放水平的影响Table 1 Effects of PLTPE on cell viability and LDH levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.2 柚叶总多酚提取物对LPS处理Caco-2细胞中IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平的影响

LPS(2 μg/mL)刺激可显著增加 Caco-2细胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌(图1)。不同浓度的柚叶总多酚提取物干预模式细胞后，细胞内 IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌水平均得到显著抑制。

图1 柚叶总多酚提取物对LPS处理Caco-2细胞中IL-1β(a)、IL-8(b)、TNF-α(c)分泌水平的影响Fig.1 Effects of PLTPE on IL-1β(a), IL-8(b) and TNF-α(c)levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

高浓度的柚叶总多酚提取物(100 μg/mL和 150 μg/mL)能够使细胞中的IL-1β水平分别较LPS模型细胞中IL-1β水平降低15.15%和19.3%，IL-8分泌水平降低23.0%和34.8%。而在TNF-α分泌水平方面，柚叶总多酚提取物(100 μg/mL 和 150 μg/mL)能够使TNF-α水平分别较LPS模型细胞中TNF-α水平降低31.9%和 36.9%。临床方面的研究提示，异常表达的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎细胞因子是导致肠组织细胞间紧密连接丢失以及细胞上皮屏障损伤的主要原因，同时也在溃疡性结肠(ulcerative colitis)和克罗恩病(Crohn’s disease)的发病过程中起着重要的作用[11～15]。而本研究结果提示，柚叶总多酚对LPS所诱发 的Caco-2肠上皮细胞炎症模型具有较好的抗炎效果。

2.3 柚叶总多酚提取物对LPS处理Caco-2细胞中IL-1β、IL-8与TNF-α的mRNA转录水平的影响

如图 2所示，LPS(2 μg/mL)处理能够显著刺激Caco-2细胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA转录。不同浓度的柚叶总多酚提取物处理细胞后，细胞内IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平均得到显著抑制。较未经过柚叶总多酚提取物处理的LPS模型组细胞而言，高浓度的柚叶总多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)能够分别有效降低LPS模型细胞中IL-1β的转录水平至16.8%和21.1%，IL-8转录水平至27.0%和35.6%。同时，柚叶总多酚提取物还能显著抑制LPS模型细胞中TNF-α的转录水平至26.5%和34.8%。抑制IL-1β、IL-8和TNF-α等炎症细胞因子的过度表达，不仅能够降低肠道组织的炎性水平，还能减缓高炎症环境所导致肠上皮细胞间细胞紧密连接丢失的发生[1,12,13]。

2.4 柚叶总多酚提取物对LPS处理Caco-2细胞的膜通透性影响

图3 柚叶总多酚提取物对LPS处理Caco-2细胞TEER(a)与FD-40(b)透过水平的影响Fig.3 Effects of PLTPE on TEER(a) and FD-40(b) flux levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

细胞膜通透性的改变程度能够反映细胞间紧密连接和细胞单层屏障功能。如图3a所示，LPS处理显著造成Caco-2细胞中跨上皮细胞电阻(TEER)值的降低。而TEER值是用于检测肠上皮细胞单层屏障功能变化的经典生物指标之一[16]，其主要反映肠上皮屏障模型的离子通透性改变情况[17]。给予不同浓度柚叶总多酚处理后，模型细胞的TEER值均显著回升(p＜0.05)。其中，柚叶总多酚(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和150 μg/mL)处理组细胞分别较LPS组细胞的TEER值升高1.27倍、1.84倍、2.10倍和2.50倍。另一方面，异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐(FD40)透过度也属于评估肠上皮细胞单层屏障功能变化的常用生物指标[16]，其主要反映肠屏障细胞模型透过大分子物质的能力，FD-40数值越高则意味着肠上皮屏障模型细胞通透性越高[18]。如图3b所示，LPS处理显著造成Caco-2细胞的通透性增高。经柚叶总多酚处理后，模型细胞的 FD-40透过水平均呈显著下降趋势(p＜0.05)。柚叶总多酚(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 150 μg/mL)处理组细胞分别较LPS组细胞的FD-40透过水平降低8.06%、18.22%、24.86%和28.91%。以上结果提示，柚叶总多酚提取物可以显著改善LPS所导致的Caco-2细胞高通透性情况的发生。

2.5 柚叶总多酚提取物对LPS处理Caco-2细胞中 Occludin、claudin-1、ZO-1和 MLCK 的mRNA转录水平影响

图4 柚叶总多酚提取物对LPS处理Caco-2细胞中细胞间紧密连接相关因子的mRNA转录水平的影响Fig.4 Effects of PLTPE on tight junction related factors mRNA expression in LPS treated intestinal Caco-2 cells

肠上皮屏障是由相邻肠上皮细胞间紧密连接所形成的环带状蛋白复合体，其主要的生理功能在于调控物质从细胞旁途径跨上皮运输，细胞间的构造稳定及细胞间的通讯等功能[19]。经qRT-PCR分析发现，LPS处理造成Caco-2细胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA转录水平显著下降(图4)。Occludin、claudin-1与ZO-1蛋白都是构成紧密连接(tight junction，TJs)的重要结构蛋白[20]。

与正常组相比，LPS组细胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA转录水平分别下降62.56%，53.63%和58.62%。相反，给予柚叶总多酚处理后，模型细胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA转录水平均显著回升。高浓度柚叶总多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)能够较LPS模型分别提升Occludin(1.57倍与1.78倍)、claudin-1(1.56倍与1.73倍)和ZO-1(1.73倍与2.02倍)的mRNA转录水平。

肌球蛋白轻链激酶(MLCK)属一类钙调素激酶，自身被激活后能够通过促肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化使其参与肌动蛋白收缩，引发细胞骨架重排，破坏细胞TJ结构，最终造成细胞间隙的开放，使得细胞间通透性增高[21]。如图4示，LPS处理较正常组而言能显著造成 Caco-2细胞中 MLCK的转录水平升高(p＜0.05)。柚叶总多酚处理后，模型细胞中MLCK的转录水平得到抑制。与 LPS组相比，最高浓度(150 μg/mL)的柚叶总多酚可显著抑制MLCK的mRNA转录水平(抑制率为31.30%)。抑制肠上皮细胞中MLCK的过度活化，对于维持肠上皮细胞屏障和细胞间紧密连接的重要作用[22]。

3 结论

本研究利用LPS构建Caco-2肠上皮细胞高通透性细胞模型研究柚叶总多酚提取物对细胞高通透性的改善效果。结果提示，柚叶总多酚能够有效抑制LPS造成的细胞损伤后 LDH外溢，提升细胞生存率。同时，柚叶总多酚可有效抑制 LPS诱发的 IL-1β、IL-8和TNF-α炎性细胞因子分泌并抑制其mRNA转录。此外，柚叶总多酚处理还能改善模型细胞的高通透性发生情况。在分子层面，柚叶总多酚能显著上调受损细胞中 TJ相关因子(Occludin、claudin-1和 ZO-1)的mRNA转录，抑制导致细胞 TJ丢失的 MLCK的mRNA高转录。综上述，柚叶总多酚对 LPS所致Caco-2细胞发生高通透性的保护作用可能与其具有较强的抗炎作用以及对细胞TJ相关因子的mRNA转录水平的调控能力有关。在后续研究中，课题组将重点针对柚叶总多酚是否具有MLCK活化过程中的上、下游信号通路的调控作用而展开深入研究。