清热养阴丹抑制大鼠口腔溃疡的发生与肠道菌群改善的关系研究*

陈夏凉 袁 晓 夏涛涛

1 浙江大学医学院附属第一医院 浙江 杭州 310003 2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006 3 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

笔者在临床治疗中采用清热为主，佐以养阴作为治疗大法，运用以“清热养阴丹”为基础方的清热养阴法治疗口腔溃疡，取得较好的临床疗效。很多研究发现中药比如黄连、灵芝、麦冬等可以直接与肠道菌群相互作用，改善肠道微生态结构和多样性，发挥对机体的代谢调控作用[1-3]。因此，笔者推测清热养阴丹具有直接调控肠道菌群的作用，这可能是清热养阴丹治疗口腔溃疡的重要原因之一。故用实验研究加以验证。

1 材料与方法

1.1 实验材料：60只SPF级健康SD大鼠，雌雄各半，体重200±20g。清热养阴丹药物(生地、生石膏各30g，玄参24g，贝母、麦冬各15g，白芍、丹皮、栀子各12g，黄连、甘草各9g，山豆根6g，加10倍量水浸泡30分钟后，煎煮

1小时，提取2次，过滤，浓缩至1g/ml密度的浓缩液)。

1.2 实验设备：高速离心机（德国艾本德公司），核酸电泳仪器（美国伯乐公司），超声粉碎机（美国SONICS公司），超低温冰箱（美国赛默飞公司）。

1.3 实验方法：分述如下。

1.3.1 动物分组：随机取40只，分5组，即正常组、模型组、清热养阴丹治疗高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组8只。剩余20只用于动物造模。所有大鼠同室分笼饲养，自然光照，自由饮水进食，饲养温度18～24℃，相对湿度50%～60%，饲养1周适应实验室环境后开始进行实验。

1.3.2 动物模型制备：选用剩余的SD大鼠20只，二氧化碳处死，无菌条件下取口腔黏膜组织置超声粉碎机磨成糊状，取弗氏完全佐剂与口腔黏膜悬液按1∶1比例，在研磨时顺同一方向逐滴加入黏膜抗原(1h加完)，加完后再研磨20rain以上，直至变为乳状(即放置后不分层)为止。在SD大鼠脊柱两侧皮内注射上述组织乳化剂，每只注射2点，每点0.1ml。间隔2周注射1次，共注射5次。由口腔专业人员观察大鼠口腔黏膜确认出现典型溃疡病变，即为口腔溃疡大鼠模型。

1.3.3 给药剂量及方法：模型建立2小时后，各组开始灌胃给药，每天1次，连续2周。清热养阴丹治疗高、中、低剂量组，根据预实验结果，按大鼠体重，分别以浓缩液6g/（kg·d）、3g/（kg·d）、1.5g/（kg·d）计算并称取所需剂量浓缩液，溶于生理盐水，制成2ml混悬液灌胃；正常组和模型组以2ml生理盐水灌胃。期间各组大鼠均以普通无菌饲料喂养。

1.3.4 肠道菌群测定：粪便收集：于药物治疗2周后，以无菌方法收集大鼠粪便。将每只大鼠粪便分别放入灭菌EP管，立即放入-80℃保存。菌群DNA提取：称取0.2g大鼠便样，放入2ml无菌磁珠管中，采用酚氯仿异戊醇抽提法提取粪便样品微生物总DNA。然后采用2次PCR扩增16SrDNAV3区，以DNA为模板，采用Touchdown-PCR进行第1次扩增，再以第1次PCR产物为模板进行Reconditioning-PCR，二代测序技术检测肠道菌群变化。

2 结果

2.1 不同剂量清热养阴丹对大鼠口腔溃疡的作用：在构建模型过程中当注射黏膜抗原的第2次（共5次）时，就发现大鼠口腔内有不同程度的充血，第3次注射后1周大鼠即开始出现口腔溃疡。中药干预之后，发现中、高剂量的清热养阴丹可显著延长大鼠口腔溃疡的复发间隔时间。所有剂量都可以显著减少口腔溃疡的数量和面积大小。高剂量可显著减少溃疡持续的时间。见表1。

2.2 清热养阴丹对肠道菌群的影响：稀释曲线和Chao数据结果表明，笔者的测序深度足够覆盖了所有的菌群，测序结果有效(图1A，B)。Chao数据表明模型组即口腔溃疡的大鼠肠道菌群的菌群多样性显著低于正常对照组的大鼠。清热养阴丹干预的低剂量和中剂量组可以提高菌群的多样性，然而高剂量组并没有增加肠道菌群的多样性。β多样性分析结果显示高剂量组菌群与模型组菌群差异性最大，表明高剂量组对口腔溃疡大鼠的肠道菌群影响最大(图1C)。通过深入的数据分析发现，清热养阴丹干预后肠道菌群在不同水平上发生了变化。尤其是目水平上的Bacillales（图1D）、科水平的Rikenellaceae(图1E)和属水平上的RC9-gut-group、Alistipes、Dorea、Gemella、hydrogenoanaerobacterium和Bamesiella的菌群的改变与口腔溃疡模型组呈显著发生密切相关。见表2。其中RC9_gut_group，在造模组中丰度增加，给药后丰度降回正常比例，并且随着剂量增加，这种恢复的幅度越大。

表1 不同剂量清热养阴丹对大鼠口腔溃疡的作用

图1 清热养阴丹干预后肠道菌群变化情况

表2 造模和用药两种处理都改变且相反的阶元

3 讨论

中医学认为，口腔溃疡属于复发性“口疮”范畴，其病因病机以“火”为主，其中脾胃伏火较为常见[4]。由于该病迁延反复，病久伤阴耗气，气阴损伤是本病迁延难愈、极易复发的内在原因。笔者前期临床病例诊治已经发现清热养阴丹对口腔溃疡的疗效显著优于普通激素，遂希望通过动物实验初步探究清热养阴丹抑制口腔溃疡发生的作用机制。通过构建口腔溃疡大鼠模型以及给予不同剂量的清热养阴丹，笔者发现清热养阴丹对大鼠口腔溃疡的疗效是呈剂量依赖性的。另外，通过肠道菌群的高通量测序分析研究发现清热养阴丹可在不同水平上改变肠道菌群的丰度，尤其是可以逆转模型组中改变的菌群，比如Bacillales和Rikenellaceae等（图1D、E）。综上，结果表明清热养阴丹具有改善口腔溃疡大鼠的肠道菌群的紊乱，这一作用可能与其抑制口腔溃疡的治疗作用密切相关。