两种分子分型技术在乳制品克诺罗杆菌污染溯源分析上的比较

郭清艳，钮冰，杨捷琳

（1.上海大学生命科学学院，上海 200444；2.上海出入境检验检疫局，上海 200135）

0 引 言

克罗诺杆菌属Cronobacterspp.(2008年之前被称为阪崎肠杆菌E.sakazakii)，在自然界中分布广泛，可在婴幼儿配方奶粉，冲调器具，奶粉加工场地及设备中分离到该菌[1-4]。阪崎克罗诺杆菌C.sakazakii作为Cronobacterspp.的代表菌种，易使免疫力低下的各阶段人群感染患病，如脑膜炎，败血症和坏死性结肠炎[5]。早产儿，体重不足的新生儿以及婴幼儿易感染C.

sakazakii，并造成40%～80%的致死率[6-9]。2002年，国际微生物食品标准委员会将E.sakazakii划分为对部分人群存在严重危害的致病菌[10]。我国食药监局在2006版的《婴幼儿配方奶粉生产许可证审查细则》中明确指出不得检出E.sakazakii[11]。

最早E.sakazakii被认为是肠杆菌科、肠杆菌属(Enterobacterspp.)中阴沟肠杆菌的生物变型菌，并被命名为“黄色阴沟肠杆菌(yellow-pigmentedEnterobacter cloacae)”。直到1980年，Farmer等做了一系列实验，结果发现“黄色阴沟肠杆菌”与柠檬酸杆菌属和肠杆菌属中的细菌有41%～50%的关联，其表型和DNA与肠杆菌属中的阴沟肠杆菌相似性更接近(50%)，由此将其归于肠杆菌属。但“黄色阴沟肠杆菌”与阴沟肠杆菌在个别生化反应上不同，为此Farmer等建议将“yellow-pigmentedEnterobactercloacae”更名为“Enterobactersakazakii”[12]。此名称被广泛地采纳，并沿用至今。2007年Iversen等通过对210株阪崎肠杆菌的多相分析方法测定，建立一个囊括了原来所有阪崎肠杆菌的新属Cronobactergen.nov。这个新属包括5个种分别是：Cronobactersakazakii、C.turicensis、C.malonaticus、C.muytjensii和C.dublinensis[13]。2012年对该属的再次修订，确定由7种菌种组成，添加C.universalis和C.condimenti。该分类是由全基因组分析支持，奠定7个菌种的分类地位[14-16]。

随着Cronobacterspp.分类的不断完整和细化，相应的鉴定分型技术也在不断发展。2002美国食品药品管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)推荐的婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分析与计数检测程序，MPN(Most Probable Number)法是阪崎肠杆菌早期的检测方法。该方法一直被认为是阪崎杆菌检测的经典方法，但耗时7 d左右，灵敏度不高且操作繁琐[17]。API 20E(bioMe’rieux,法国)是革兰氏阴性肠道菌鉴定的常用的商品化试剂条[18]。Centinkaya[19]，Turcovsky[20]和Pan[21]都曾利用此方法对E.sakazakii进行生化鉴定。该方法成本低，反应快，但只可鉴定到属的水平，且结果判定会因人而异，易产生误差。脉冲场凝胶电泳(PFGE)是针对致病菌爆发分子流行病学调查的黄金标准方法[22]。但PFGE存在一定限制,即使通过软件分析PFGE凝胶的图像，也需要对凝胶中位移或弱条带进行主观的视觉判定，这样就会引入人为误差[23]。

相比之下，全基因组比较分析揭示了大量的遗传多样性，可用于将病原菌进行快速准确地分类，甚至到单一菌株水平。针对遗传相关性十分接近的致病菌全基因组测序比PFGE更加准确且分辨率更高，并提供许多额外的信息，包括MLST、单核苷酸多态性、功能基因分析等[24]。Antwerpen对15株土拉弗朗西斯菌(T.tularensis)的进行全基因组测序，推出了一种新的基因研究方法MLST+[25]。McRobb结合了全基因组缺失基因分析和SNP系统进化树，对于研究流行病学致病菌提供了更高的分辨率[26]。目前对大肠杆菌已有较为深入的研究，其被分为许多亚型，每种亚型都具有不同的毒性和抗性。Ferdou发现对132株产志贺毒素的大肠杆菌分离株进行全基因组测序，发现属于44种不同的序列类型(ST)，42种血清型和14种STX亚型组合[27]。

由于Cronobacterspp.分类地位的变化，导致目前对于Cronobacterspp.的溯源体系更为复杂多样，采用何种更加有效的溯源分析方法，有效识别污染来源，对乳制品生产中Cronobacterspp.的防控更为重要。我们期待通过比较两种分子分型方法，证实全基因组测序方法是对Cronobacterspp.进行溯源分析或功能分析的重要研究手段。

1 材料与方法

1.1 材料

2005-2006年，在上海口岸对进口乳品进行阪崎肠杆菌检测，共分离获49株阪崎肠杆菌，乳制品包括婴幼儿奶粉，食品配料包括乳清粉和乳清蛋白粉，奶酪，奶粉以及其他类型的进口乳制品，其中29%是乳清粉和乳清蛋白粉。乳制品来自9个不同的国家，其中新西兰占最大比49%。样品信息详见表1。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离、复苏与DNA的提取

参照美国FDA和加拿大卫生部健康产品和食品部的推荐方法[28-29]，进行样品处理和E.sakazakii的分离。生化鉴定按API 20E试剂条产品说明书进行。按无菌操作程序进行取样前的样品袋表面处理。每份样品取约40 g，放入已预热到45℃装有360 mL无菌水的三角烧瓶中，轻轻摇动使其充分溶解，36℃孵育过夜。移取上述混合液10 mL转种到90 mL无菌肠道杆菌增菌肉汤中，36℃孵育过夜。充分混合增菌培养液，分别在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂平板上进行直接涂布或划线分离，36℃培养过夜。过夜培养后，观察平板上的菌落特征，挑取紫色及粉色疑似菌落分别划线接种到胰蛋白酶大豆琼脂平板，25℃培养48～72 h。挑取TSA琼脂平板上所有菌落，根据API 20E试验指南进行生化鉴定，同时做氧化酶试验。

分离获得的所有菌株在-80℃下使用磁珠保存法储存至今。49个菌株被成功复苏，制成菌悬液。采用CTAB法提取细菌基因组DNA。

1.2.2 基因组测序组装

采用Illumina HiSeq 2500平台完成全基因组测序。对DNA碎片进行环化扩增，文库构建。经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，进行初步定量稀释、检测，插入片段大小再次准确定量确保文库质量。最后进行测序。原始数据进行过滤处理后，将有效数据(Clean Data)。使用 SOAPdenovo（version 2.04）软件进行组装[30-31]。

1.2.3 多位点序列分型

目前数据中现有的Cronobacterspp.记录有2000多株，分别来自23个以上的国家，源自中国的菌株占33.26%。管家基因为基因组内400-600bp的核苷酸序列，每个位点根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱，也就是这株菌的序列型[32]。

Cronobacterspp.的7个管家基因分别是atpD,fusA,glnS,gltB,gyrB,infB,pps。菌株的序列型通过CronobacterMLST公共数据库上(https：//pubmlst.org/cronobacter/)的在线工具确定，选择Sequence query下的MLST，再将49个菌株的全基因组数据粘贴到数据库，得到菌株的ST[33]。并在线使用geoBRUST软件，依据7管家基因位点和国家生成分布图(图1)。

表1 49株菌株的基本信息和序列型

1.2.4 单核苷酸多态性位点分析

对32株ST13的阪崎克罗诺杆菌进行SNP分析，使用软件SMALT和SAMtools[29-30]。选取最早分离得到的菌株CS-1作为参考序列。使用VCFTools软件对VCF文件过滤，参数设定为得分最低30，深度最小8.0以及等位基因频率最小0.90[34-36]。SNP分析结果包括同义突变和反义突变。每个突变位点被串联一起，依据最大似然法构建进化树，最后使用Figtree v 1.3软件进行可视化和注释。

2 结果

2.1 MLST分型

49个C.sakazaii菌株通过MLST分型，分为8个不同的序列型，包括 ST1，ST4，ST 13，ST375，ST12，ST21，ST233和ST42。各序列型占比极不平衡。图1中ST13的Csakazakii(n=32，65.3%)占绝对优势，其次是 ST 4(n=6，12.2%)，ST 375占 比 8%(n=4)。 ST12，ST 233，ST42，ST 12均对应单个菌株。ST13菌株中来源组成多样且不平均，共6个国家，其中新西兰来源占50%（16/32）。ST4由三个国家组成，美国占比50%。ST 375由新西兰和波兰占一半比例。图2是产品种类与序列型之间的关系。同样ST 13菌株的产品类型组成最为复杂，其中婴幼儿奶粉占比最大，其次是ST 4菌株来自4种产品组成，食品配料占比最大。

图1 菌株的序列型与国家之间的关系

图2 菌株的序列型与产品类别之间的关系

2.2 CC13菌株的SNP分析

为了对ST13的C.sakazakii的深入分析，采用SNP方法进行分型，结果分为4个Group和5个单独的菌株。表2统计了各ST13菌株详细的SNP数量，由图3可知，Group 1包括12个菌株，CS-6和CS-37单核苷酸多态性位点最多11。Group2形成两个明显的分支，每个分子由4个菌株组成。Group3仅由两个菌株组成，来自新西兰的CS-19和CS-36。Group4由5个菌株组成，最大的SNP数仍是11。此外独立的5个菌株分别是CS-72，CS-18，CS-71，CS-56和CS-48,其中CS-71含有5378个SNP,远高于其他菌株的SNP数。

表2 ST13 C.sakazakii菌株的SNP分析结果

图3 ST13株阪崎克罗诺杆菌的系统发育树

3 讨论

一直以来，MLST多位点序列分型方法被认为是区分Cronobacterspp.菌株稳定且可靠的方法。图1显示8种已知不同的序列型之间的关系，并可见菌株序列型和地理位置上存在的不平衡分布，有一定相关性，相同序列型的菌株聚簇明显跟菌株的分离国家相关[37-38]，比如说CC13有超过一半的菌株源自新西兰。MLST分型共得到8个不同的ST序列型，其中4个ST(ST 1，ST4，ST12，ST13)都与C.sakazakii感染临床案例有关[39-41]。值得注意的是，ST13菌株在本研究占有绝对优势比例（65%）。1994年法国的新生儿重症监护室因C.sakazakii感染引发疾病爆发，调查分离得到5株ST 13的C.sakazakii菌株[40]。分离自婴幼儿乳制品的10株C.sakazakii，全部属于ST13。当时未见国内因感染阪崎肠杆菌的临床案例报道，可能与当时对该菌的认识不够透彻相关。ST4菌株的来源多样，包括美国，意大利，和新西兰。相隔甚远的三个国家，位于三个不同的大洲，证明在ST4C.sakazakii的分布广泛以及较强的适应性。

针对食源性致病菌流行病事件的溯源分析，多位点序列分析是进行初步分型的有力工具。但对于对序列相似较高的菌株的分型，存在一定限制。单核苷酸多态性位点分析（SNP分析）被证明在DNA水平上拥有最全面最准确的的分辨能力。故我们选择SNP分析对32株ST13C.sakazakii进一步分型分析。图3可见由32个ST13菌株组成的最复杂的系,通过SNP分型，被分成4个Group和5个独立的菌株。5个独立的菌株中，源自法国的CS71含最多的SNP数，距离参考序列CS1最远。而其余4个独立的菌株均源自新西兰，SNP数在8～15之间。在图3中Group1是相对最复杂的组分，其中CS61和CS32，CS14和CS66在Group1中分别拥有共同的祖先，且也源自相同国家新西兰和美国，证明来自同一国家的菌株倾向于聚簇在一起。Group2由8个菌株组成，形成两个明显分支，两个分支的传播路径均是从大洋洲的新西兰，澳大利亚到欧洲的法国。Group3是源自新西兰的两株阪崎克罗诺杆菌，再次证明序列型与国家之间的相关性。由5个菌株组成的Group4，传播路径是从美国到澳大利亚，再至新西兰。明显Group2和Group4的传播方向在地理上刚好构成一个三角循环，不难想象在2005-2006年间，在欧洲，大洋洲，北美洲的乳制品之间的频繁贸易，的确对ST13C.sakazakii的传播有促进作用。

通过全基因组测序，我们不仅可以获得其MLST分型结果，还可以对相同ST的菌株做进一步的个性化分析，如文中采用了单核苷酸多态性位点分型方法，成功对32株ST13菌株进一步分型，为类似致病菌的溯源分析提供思路。随着下一代测序技术的不断发展和普及，如今二代测序的成本已大大降低，测序时间也大为缩短，其价格基本等同于单做多位点序列分析的费用，因此通过本次研究，我们提倡在对致病菌进行溯源分析时采用全基因组分析，同时还可以深入进行基因组的功能分析。

4 结 论

本研究为乳制品携带C.sakazakii致病菌污染事件的分子溯源提供了技术储备,丰富了C.sakazakii的MLST数据库，为应用全基因组测序进行MLST和SNP方法研究分析不同来源Cronobacterspp.的分子流行病学提供依据,有助于该菌的主动监测和溯源,为预防和控制与该菌有关的食源性疾病发挥重要的作用。