新疆不同地区开菲尔粒中乳酸菌的分离鉴定及筛选

王江月，王亮，巩小芬，高恩燕，张恩鹏，刘朋龙，李阳

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013，2.新疆天润生物科技股份有限公司，乌鲁木齐 830088）

0 引 言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用碳水化合物发酵并且产生大量乳酸的细菌的总称，是革兰氏染色阳性、不运动、无芽孢、过氧化氢酶阴性、发酵葡萄糖产生50%以上乳酸，而且在无氧的环境中生长良好的兼性厌氧细菌[1]。乳酸菌是主要的酸乳发酵菌种，产生多种风味物质及有益物质。乳酸菌是于人体内存在的益生菌，它可以调节人体胃肠道菌群，维持肠道内微生物动态平衡，改善乳糖不耐症，降低胆固醇，降低肿瘤发病率等[2]。

开菲尔粒（Kefir grains）是一种传统的酒精发酵乳饮料——开菲尔（Kefir）的发酵剂，可以用于家庭或工业化的开菲尔生产[3]。开菲尔粒的主要组成菌为乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等。开菲尔可调节肠道免疫系统[4]，具有抑菌[5]及抗肿瘤活性[6]。这与开菲尔粒中包含的大量益生菌有密不可分的关系。

在开菲尔饮品的生产过程中，由于传统的开菲尔粒的特性，离开开菲尔粒就无法增殖传代，且活力不稳定，容易发生杂菌污染，共生菌群失衡导致品质下降[7]。从中分离出益生乳酸菌进行酸乳发酵，可避免此类现象发生并保留其益生性能。

本试验以新疆开菲尔粒为研究对象，对开菲尔粒发酵过程中的乳酸菌进行分离、培养、发酵性能测定和筛选，以期获得产酸性好、风味浓郁的优良乳酸菌菌株，其目的为工业化酸乳复合菌种发酵剂的研制提供优良备选菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

开菲尔粒采集于新疆不同地区牧民家庭。

MRS肉汤培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；过氧化氢、酚酞、乙醇、氢氧化钠、三氯乙酸、邻苯二胺、盐酸、亚硫酸氢钠、可溶性淀粉、0.10 mol/L碘标准溶液、0.01 mol/L碘8标准溶液、碳酸氢钠、琼脂，国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖、引物、LA酶Mix、溴化乙锭、TE缓冲液、细菌DNA提取试剂盒，上海生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

超净工作台（AIRTECH垂直送风SW-CJ-2FD），苏净安泰；全温空气摇床（QYC200），上海福玛设备有限公司；小型高速离心机（Eppendorf 5418R），德国Eppendorf；p H计（FE20K），梅特勒-托利多；微量紫外分光光度计（UV-1601），北京瑞利分析仪器有限公司；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司；高速冷冻离心机，凯特试验仪器公司；电泳仪（Mini-Sub cell GT），美 国 BIO-RAD；厌 氧 罐（AG0025A）、厌氧袋（AN 0025A），英国OXOID。

1.3 方法

1.3.1 开菲尔粒的活化

将开菲尔粒按3%比例接种到经灭菌的牛乳中，37℃、140 r/min摇瓶培养24 h，用已灭菌的筛子过滤出开菲尔粒，用生理盐水冲洗干净，加入到新的灭菌乳中37℃、140 r/min摇瓶培养24 h。循环三次。

1.3.2 菌种的分离纯化

将活化后的开菲尔粒加入到新的灭菌乳中，37℃、140 r/min摇瓶培养48 h，每隔4 h取样1 mL开菲尔加入9 mL无菌水中，混匀后用无菌水按10倍比例逐级稀释。吸取合适梯度的开菲尔稀释液100μL涂布接种于MRS培养基平板上，37℃厌氧培养，待菌落长出后挑取优势菌落在MRS平板上反复划线分离至菌落纯，并进行过氧化氢酶和革兰氏染色试验，将过氧化氢酶阴性和革兰氏阳性菌株接种到MRS斜面培养基中，经培养后置4℃冰箱中保存备用。挑取单菌落于MRS液体培养基中培养48 h，吸取1 mL菌液于2 mL冻存管中，然后添加1 mL灭菌30%甘油，封口膜密封好后置于-75℃超低温冰箱中冻存[8]。

1.3.3 乳酸菌16SrDNA序列鉴定和系统发育树构建

使用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离的乳酸菌DNA，采用16Sr DNA通用引物（正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将在1 500 bp处有清晰的条带的PCR产物送往南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序，将测得的DNA序列提交Gen Bank数据库，使用NCBI的BLAST检索系统（http：//www.ncbi.nlm.Gov/Blast/）对序列同源性进行对比分析，99%～100%全序列相似性的细菌，判定为同一个种[9]。使用软件MEGA5.05进行序列分析，采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析并构建进化树。

1.3.4 发酵性能测定

1.3.4.1 初级筛选

凝乳时间。挑取一环菌落，接种到MRS培养基中，37℃、140 r/min培养24 h。在灭菌牛乳中接入菌液，接种量为1×106cfu/mL，37℃静置培养至凝乳，并记录时间。最长静置时间不能超过72 h。

酸度测定。灭菌牛乳凝固后，放入冰箱4℃冷藏，冷藏24 h后测定滴定酸度（GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[10]）。

持水率测定。灭菌牛乳凝固后，将其4℃冷藏24 h后，测定其持水率。取一定量的酸乳，8 000 r/min，4℃离心15 min。弃上清液后称重，并计算沉淀所占酸乳百分比。

感官评价。乳酸菌发酵的牛乳凝固后，放入冰箱4℃冷藏，冷藏24 h后组织20名具有感官评价资质的专家对酸乳的甜度、酸度、组织状态和香味进行感官评价，每项5分。取适量试样于50 mL烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态，再闻气味，然后用温开水漱口，品尝样品的滋味。

1.3.4.2 次级筛选

后酸化能力测定。牛乳凝固后放入4℃冰箱中保存，测定酸奶冷藏 1、5、10、15、20 d后的酸度（GB 5009.239-2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》[10]）。

产香能力的测定。灭菌牛乳凝固后，将其4℃冷藏24 h后，测定乙醛和双乙酰的含量[11]。

冷藏期间活菌数的测定。牛乳凝固后放入4℃冰箱中保存，将冷藏1、5、10、15、20 d后的酸乳稀释至合适梯度，涂布于MRS培养基上进行平板计数。

2 结果与分析

2.1 菌株分离及鉴定结果

将过氧化氢酶阴性和革兰氏染色阳性的菌株进行16SrDNA测序并且使用NCBI的BLAST检索系统对序列同源性进行对比分析后，得到22株开菲尔乳杆菌，3株肠膜明串珠菌和2株假肠膜明串珠菌。

图1 分离出的乳酸菌基于16Sr DNA序列构建的分子系统发育树

由图 1可以看出，NR 2、NR 3、XR 2、XR 3、XR 4、SXR 1、SXR 2、SXR 3、SXR 4、SXR 5、SKR 1、SKR 2、SKR 3、SKR 4、TXR 1、TXR 2、TXR 3、TXR 4、FXR 1、FXR 2、FXR3、FXR 4与Lactobacilluskefiristrain NM 180-3的距离非常接近；乳酸菌XR 1、NR 1、NR 4与LeuconostocmesenteroidesSD 7015的距离非常接近；T2、T 8与Leuconostocpseudomesenteroidesstrain 607非常接近，因此，NR 2、NR 3、XR 2、XR 3、XR 4、SXR 1、SXR 2、SXR 3、SXR 4、SXR 5、SKR 1、SKR 2、SKR 3、SKR 4、TXR 1、TXR 2、TXR 3、TXR 4、FXR 1、FXR 2、FXR 3、FXR 4被鉴定为Lactobacilluskefiri，XR 1、NR 1、NR 4被鉴定为Leuconostocmesenteroides，T2、T8被鉴定为Leuconostocpseudomesenteroides。

表1 开菲尔乳杆菌的初级筛选结果

2.2 发酵性能测定

2.2.1 初级筛选

在酸乳生产过程中凝乳时间过短或过长，都会对酸乳的风味、质构等产生影响。凝乳时间过快，产酸速率过快，不利于香气成分的形成，并且对凝乳状态也会有不利的影响；凝乳时间过长，虽然有利于香气成分的形成，但容易导致杂菌污染和生产效率下降[12]。SXR 2、SXR 5、 SKR 1、 SKR 3 和SKR 4在72h没有出现凝乳，说明这几株菌凝乳性能差。开菲尔乳杆菌中凝乳时间最短的是SXR 1和FXR 3，为 10 h。肠膜明串珠菌中T2和T8凝乳时间最短分别为8 h和10 h。

酸度是影响酸乳加工周期的长短、生产效率的快慢和风味优劣的一个重要指标，产酸能力是酸奶生产用菌种筛选的重要指标，一般以产酸能力中等，同时前产酸力较强，后产酸较弱为优良菌种筛选标准[13]。开菲尔乳杆菌中酸度最高的是 FXR 3，高达144.1°T；最低为SKR 2，65.6°T。根据GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[10]，酸乳中的滴定酸度不得小于 70°T，SKR 2小于70°T。酸度在公认的较合适范围 70～110°T[14]的有NR 2、 NR 3、 XR 2、 XR 3、XR 4、SXR 3、SXR 4、TXR 1、TXR 2、TXR 4、FXR 2、FXR 4。明串珠菌中T 2和T 8发酵酸度超过110°T，但可用于发酵干酪及其他用途，或与其他菌株复配可以抑制其发酵酸度过高的现象。XR 1、NR 1和 NR 4的发酵酸度均满足70～110°T的要求。

持水率也是酸乳的的一个重要评价指标。持水率过低会有乳清析出，乳清析出会直接影响酸乳的组织形态，不能成型，从而口感也会相应下降。开菲尔乳杆菌中持水率最高的是FXR 3，高达81.8%；最低的是SKR 2，39.6%，和酸度的高低呈一定的相关性。明串珠菌中除NR 4外，其余四株菌持水率均能达到70%以上，持水率较高。

表2 明串珠菌的初级筛选结果

开菲尔乳杆菌中风味较好的有NR 2、XR 3、SXR 1、TXR 3。其中甜度最高的是NR 3、SXR 4，最低的是XR 2、XR 4；酸度最高的是FXR 3，最低的是SKR 2;组织状态最好的是FXR 3，最差的是NR 3、SKR 2、FXR 4，可以看出组织状态与持水率和酸度都有一定的相关性；香味最好的是NR 2，最差的是XR 4。明串珠菌中风味最好的是XR 1，NR 1次之。

以风味优劣为首要标准，结合酸度和持水率，初步筛选出比较合适作为发酵剂候选菌株的有开菲尔乳杆菌 NR 2、XR 3、SXR 1、SXR 3、SXR 4、TXR 2、TXR 3、TXR 4、FXR 1、FXR 3风味较好并且发酵时间、产酸和持水率都较优，肠膜明串珠菌NR 1、XR 1风味好并且酸度持水率都较好。

2.2.2 次级筛选

2.2.2.1 后酸化能力

后酸化能力的强弱对于酸乳的保质期的长短是一个决定性的因素。优良的乳酸菌一般后酸化能力比较弱，抗后酸化能力强，产品货架期长，酸乳4℃储藏3周酸度仅增加7.5～10°T[15]。由表3可以看出，在21 d内酸度在 110°T以下的有 NR 2、XR 3、SXR 3、TXR 2、TXR 3、TXR 4、FXR 1、XR 1。 酸 度 增 加 最 少 的 是SXR 3，仅增加了6.3°T；酸度增加最多的是SXR 4，增加了34.9°T。酸度增加在7.5～10°T范围内的有NR 2、TXR 4、XR 1。XR 3的酸度增加了10.5，仅高于最大范围0.5°T，所以将其纳入接受范围内。FXR 3酸度增加并不多，但因其初始酸度过高，以至于在冷藏期间一直保持较高的酸度，其滋味可能难以被消费者接受。

表3 后酸化能力

2.2.2.2 产香能力

影响酸乳风味的物质种类繁多，而且并不是每一种风味物质都对食品的风味起决定性作用，乳酸菌中与风味有关的物质主要有乳酸、醋酸、乙醛、双乙酰、3-羟基-2-丁酮等[16]。为此，人们在研究风味时，多是选择几种主要的风味物质进行研究。乙醛和双乙酰是构成酸乳典型风味的重要化合物。乙醛的产生可以使酸乳具有典型的、新鲜的香味。要使酸乳达到典型的香味，乙醛的浓度需要在10～15μg/mL[17]。双乙酰是酸乳的另一个重要的风味物质，乳酸菌利用柠檬酸生成双乙酰，赋予酸乳一种坚果果仁香味，即使含量甚微，但是仍可大大改善酸乳的风味[18]。分析乙醛及双乙酰含量，对酸乳的生产有着重要的意义。

表4 产乙醛和双乙酰能力

由表4可以看出，除XR 3和FXR 3外，其余菌株的乙醛浓度均在10～15μg/mL范围内，产乙醛能力较好。10株菌双乙酰含量均一般，但是即使含量低，也可大大改善酸乳风味，并且乙醛和双乙酰之间的比例也影响酸乳的风味。虽然酸乳的风味主要受乙醛、双乙酰含量影响，但与酸奶中其他风味物质也有关系。

2.2.2.3 冷藏期间活菌数

活菌数是体现乳酸菌发酵制品是否具有保健性的重要指标之一，产品中具有高的活菌数才能确保最终

有较多的乳酸菌进入人体内发挥其保健功能[19]。由图2可以看出，10株菌的活菌数在3周内都呈下降状态，但都维持在1×106cfu/mL以上。SXR 3和TXR 3相对来说活菌数较少，在冷藏初期活菌数分别有3.5×107cfu/mL和1.3×107cfu/mL，冷藏3周后活菌数分别有2×106cfu/mL和2.7×106cfu/mL。在冷藏初期活菌数最高的是XR 3，活菌数为3.8×108cfu/mL；在冷藏3周后活菌数最高的是SXR 4，活菌数有1.0×108cfu/mL。FXR 1活菌数下降程度最小，XR 3活菌数下降程度最大。其中SXR 4和FXR 3在冷藏期间酸度一直处于较高的水平，但活菌数下降程度并不大，可能因其耐酸性比较好。

图2 冷藏期间活菌数

3 结 论

对来自新疆不同地区的7种开菲尔粒中的乳酸菌进行了的分离鉴定，共分离出22株开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiristrain)，3株肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和2株假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)。经初级筛选得到发酵时间较短、酸度适宜、持水率高并且风味及组织状态好、感官评价高的10株乳酸菌。然后再根据冷藏3周酸度变化、冷藏期间乳酸菌活菌数的测定以及产乙醛和双乙酰能力，最终挑选出NR 2、XR 3、TXR 4、XR 1。其中NR 2和XR 3冷藏期间活菌数一直维持在较高水平，冷藏3周酸度升高程度较小，产乙醛能力较强，并且感官评价较好。TXR 4持水率高，冷藏3周酸度升高程度较小，产乙醛能力较强，并且感官评价较好。XR 1产酸能力强，持水率高，组织状态好，冷藏3周酸度升高程度较小。因此，NR 2、XR 3、TXR 4、XR 1四株菌可作为为酸乳复合菌种发酵剂的配伍菌种使用。同时，本研究中发现几株产酸性能强的菌株FXR 3、T 2、T 8等，可用于干酪或酸饮料的生产。