长爪沙鼠糖尿病近交系培育过程中血液生理生化指标的动态变化

王 迎，李 迎，王东平，郭 萌，霍学云，李长龙，陈振文，杜小燕*

(1.首都医科大学实验动物科学部，北京 100069； 2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071； 3.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118； 4.首都医科大学基础医学院，北京 100069)

长爪沙鼠(Merionesunguiculatus或Mongolian gerbil)是啮齿目、仓鼠科、沙鼠亚科、沙鼠属的动物，国内主要分布于内蒙古及河北、甘肃、宁夏等草原地带[1]，自上世纪60年代开始作为实验动物应用于医学实验之中。长爪沙鼠是多功能实验动物，在病毒学、细菌学、寄生虫学等领域都有很广泛的应用[2-4]。早在1972年，Boquist[5]发现在长爪沙鼠群体中有肥胖伴随血糖较高的动物，虽然比例较低(3/42，7.14%)，但其病理特征和人的糖尿病较相似。近年来，研究者又发现由于繁殖期的长爪沙鼠伴有高血糖和动脉硬化等症状，其体内类脂质比大鼠高3倍，可能是研究糖尿病、肥胖病的优良实验动物[6]。本团队在进行长爪沙鼠近交系的培育中发现一个分支的动物血糖较高，高血糖比例达到21.33%，因此开始定向培育这一分支，并在培育过程中对动物血液生理生化指标进行了监测。本研究用近亲繁殖兄妹交配的方法定向培育糖尿病长爪沙鼠近交系，对培育过程中从第9到第14代的动物血液生理生化指标进行了动态检测。本课题组通过研究长爪沙鼠糖尿病动物模型近交系品系培育过程中的这些指标，有效掌握了培育过程中沙鼠特性的变化规律，为这一模型群体的建立和今后的应用提供了基础数据和背景资料。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级成年糖尿病近交系长爪沙鼠165只(6～12月龄)，体重在50～80 g之间。F9代10只(雌6，雄4)；F10代30只(雌18，雄15)；F11代50只(雌25，雄25)；F12代42只(雌21，雄21)；F13代20只(雌12，雄8)，F14代13只(雌7，雄6)。首都医科大学实验动物中心自行培育，环境控制如下：温度为18℃～26℃，相对湿度30%～60%，日常饲喂60Co照射消毒饲料及饮用无菌水，自然光照。本实验通过首都医科大学实验动物和动物实验伦理委员会批准(No.：AEEI-1417-032)，在研究过程中按照实验动物使用的3R原则给予动物人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

各项检测和试剂参考前期的研究方法和文献进行，包括检测生理生化指标的各项配套试剂[7-8]。仪器和器械均和前期的研究相同[7-8]。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集

采集方法参考相关文献[7-9]，在实验前动物空腹12～16 h，分两组采集血液，经眼眶静脉取血后生化指标测定组血样静置30 min后5000 r/min离心10 min，分离血清备用；生理指标测定组血样用1%的肝素抗凝，采血后快速混匀，静置备用。

1.3.2 各项测定指标

17项血液生化指标以及22项血液学指标均和前期研究相同[7-8]。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析。多组均数比较进行多重比较。P< 0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 血清生化动态变化

2.1.1 血清蛋白的动态变化

糖尿病长爪沙鼠近交系培育过程中F9～F14代动物的白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)趋势平稳(见图1)，但多重比较发现，白蛋白在F10、F11、F12代与F13和F14代差异有显著性(P< 0.01)；总蛋白在F11代与F10、F13代差异有显著性(P< 0.01)，在F11代与F9、F12、F14代差异有显著性(P< 0.05)。

图1 血清蛋白的动态曲线Figure 1 The dynamic curves of serum proteins

2.1.2 血清血脂的动态变化

糖尿病模型长爪沙鼠近交系培育过程中F9～F14代动物的甘油三酯(TG)含量从F11代之后趋势平稳，高密度脂蛋白(HDL)含量趋势平稳，总胆固醇(CHOL)含量呈下降趋势。多重比较结果显示，高密度脂蛋白的含量在F10代与F14代差异有显著性(P< 0.05)，与F13代差异亦有显著性(P< 0.01)，在F11代与F13代差异有显著性(P< 0.05)。甘油三酯的含量在F11代与F10～F13代差异有显著性(P< 0.01)，与F9、F14代差异亦有显著性(P< 0.05)(图2)。

2.1.3 血清代谢产物的动态变化

长爪沙鼠糖尿病近交系培育F9～F14代过程中动物血清中尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、肌酐(CRE)含量比较稳定，变化较小。但是尿酸(URIC)含量随代数呈下降趋势，F11代后呈上升趋势。多重比较发现(图3)，尿酸含量F13、F14代与F10～F12代差异有显著性(P< 0.01)，F9代与F11代差异有显著性(P< 0.05)；肌酐含量F14代与F9～F13代差异有显著性(P< 0.01)。

2.1.4 血清酶的动态变化

糖尿病模型长爪沙鼠近交系动物碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)含量F9～F14代趋势平稳；乳酸脱氢酶(LD)、肌酸激酶(CK)、淀粉酶(AMY)含量的趋势呈上升趋势。多重比较结果显示，碱性磷酸酶含量在F11代与F9、F12代差异有显著性(P< 0.05)，与F13、F14代差异亦有显著性(P< 0.01)，在F13代与F10、F12代差异有显著性(P< 0.05)；谷丙转氨酶含量在F10代与F11、F14代差异有显著性(P< 0.05)，F11代与F13代差异有显著性(P< 0.05)；乳酸脱氢酶含量在F13、F14代与F9～F12代差异有显著性(P< 0.01)，F11代与F12代差异有显著性(P< 0.05)；肌酸激酶含量在F9代与F10、F11代差异有显著性(P< 0.05)，F13、F14代与F10～F12代差异有显著性(P< 0.01)；淀粉酶含量在F14代与F10、F12代差异有显著性(P< 0.05)(图4)。

2.1.5 血清葡萄糖和镁离子的动态变化

糖尿病模型长爪沙鼠近交系培育中F9～F14代动物的血糖(GLU)含量呈上升趋势，均值从F9代的(5.7±2.54) mmol/L到F14代为(6.63±2.15) mmol/L；镁离子(MG)含量趋势平稳，镁离子含量F11代与F9、F13、F14代差异有显著性(P< 0.05)，F13代与F10、F12代差异有显著性(P< 0.05)(见图5)。

2.2 血细胞动态变化

2.2.1 白细胞及分类的动态变化

长爪沙鼠糖尿病近交系培育过程中F9～F14代的白细胞(WBC)、中性粒细胞(NEUT)、中性粒细胞百分数(NEUT%)、淋巴细胞(LYM)、淋巴细胞百分数(LYM%)、单核细胞(MON)、嗜碱性粒细胞(BAS)、嗜碱性粒细胞百分数(BAS%)趋势平稳，单核细胞百分数(MON%)呈上升趋势，嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜酸性粒细胞百分数(EOS%)呈下降趋势。多重比较发现，白细胞计数在F13代与F10～F12代差异有显著性(P< 0.05)；单核细胞计数在F14代与F9～F13代差异有显著性(P< 0.01)；中性粒细胞计数在F11代与F12代差异有显著性(P< 0.05)，F13代与F10、F12代差异有显著性(P< 0.05)；嗜酸性粒细胞计数在F11代与F10、F14代差异有显著性(P< 0.05)；嗜碱性粒细胞计数在F13代与F10、F12代差异有显著性(P< 0.05)；淋巴细胞百分数在F11代与F12代差异有显著性(P< 0.05)；单核细胞百分数在F14代与F9～F13代差异有显著性(P< 0.01)；中性粒细胞百分数在F12代与F11、F13代差异有显著性(P< 0.05)；嗜酸性粒细胞百分数在F11代与F14代差异有显著性(P< 0.05)(图6和图7)。

图2 血清脂类的动态曲线Figure 2 The dynamic curves of serum lipids

图3 血清代谢产物的动态曲线Figure 3 The dynamic curves of serum metabolites

图4 血清酶的动态曲线Figure 4 The dynamic curves of serum enzymes

图5 血清葡萄糖和镁离子动态曲线Figure 5 The dynamic curves of serum glucose and magnesium ions

图6 白细胞相关指标动态曲线Figure 6 The dynamic curves of white blood cell-related indicators

图7 白细胞分类百分比的动态曲线Figure 7 The dynamic curves of leukocyte classification percentages

2.2.2 红细胞及相关指标的动态变化

糖尿病模型长爪沙鼠近交系培育过程中动物的红细胞(RBC)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白(HGB)含量呈下降趋势，平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)呈上升趋势，平均红细胞体积(MCV)、红细胞分布宽度(RDW)趋势平稳。多重比较结果显示，红细胞计数、血红蛋白含量、红细胞压积在F11代与F10、F12、F13代差异有显著性(P< 0.01)，F14代与F9～F13代差异有显著性(P< 0.01)；平均红细胞体积在F10代与F11～F13代差异有显著性(P< 0.05)，F14代与F11～F13代差异有显著性(P< 0.01)；平均血红蛋白含量在F14代与F9～F13代差异有显著性(P< 0.01)；平均血红蛋白浓度在F11代与F12代差异有显著性(P< 0.05)，F14代与F9～F13代差异有显著性(P< 0.01)；红细胞分布宽度在F9代与F13代差异有显著性(P< 0.05)，F14代与F9～F11代差异有显著性(P< 0.05)(见图8)。

图8 红细胞相关指标动态曲线Figure 8 The dynamic curves of red blood cell-related indicators

2.2.3 血小板及相关指标的动态变化

糖尿病模型长爪沙鼠近交系培育过程中动物的平均血小板体积(MPV)呈上升趋势，血小板分布宽度(PDW)趋势平稳，血小板(PLT)含量、血小板压积(PCT)上升到F11代之后趋于平稳。多重比较发现，血小板含量、血小板压积在F9代与F11、F13代差异有显著性(P< 0.05)；平均血小板体积在F14代与F9～F13代差异有显著性(P< 0.01)(见图9)。

3 讨论

血液生理生化指标是实验动物重要的生物学特性指标，在近交系动物的培育过程中开展血液生理生化监测和研究，不但能了解该过程中动物生物学特性的变化，还可比较每项生理生化指标的变化规律，及其如何在随着近交繁殖代数的增加趋于一致和稳定。因此，本课题组在长爪沙鼠糖尿病近交系的培育过程中进行生理生化指标的检测具有重要意义。

影响动物的血液生理参数的因素包括两个方面：自身的遗传因素与环境因素[7]。本研究的结果显示，在17项血液生化指标中，白蛋白、总蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白、尿素氮、总胆红素、肌酐、碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、镁离子含量在F9～F14代中均趋于平稳，而尿酸、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、淀粉酶、血糖含量趋势随着代数上升而上升；总胆固醇含量趋势随着代数上升而下降。各项指标在F9～F14代之间进行多重比较，血糖、总胆固醇、尿素氮、总胆红素、谷草转氨酶这五项血液生化指标差异无显著性，而淀粉酶、高密度脂蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、镁离子含量差异有显著性(P< 0.05)，尿酸、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、白蛋白、总蛋白、甘油三酯、肌酐含量差异亦有显著性(P< 0.01)。这些数据说明在近交系的培育中不同的代数对大多数生化指标显现出较大影响，而总体而言到F14代时，各项指标均趋于平稳，从本课题组对后面F16代的初步统计结果(本文未展示数据)来看，从F14代后，生理生化指标基本稳定。这也间接反映出接近完成F20代近交系培育后，动物的生物学特性也相对更稳定了。

图9 血小板相关指标动态曲线Figure 9 The dynamic curves of platelet-related indicators

糖尿病模型长爪沙鼠近交系培育过程F9～F14代的血细胞指标中，单核细胞百分数、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、平均血小板体积呈上升趋势，嗜酸性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞百分数、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积呈下降趋势，白细胞计数、中性粒细胞计数、中性粒细胞百分数、淋巴细胞计数、淋巴细胞百分数、单核细胞计数、嗜碱性粒细胞计数、嗜碱性粒细胞百分数、平均红细胞体积、红细胞分布宽度、血小板分布宽度、血小板含量、血小板压积指标趋势平稳。各项指标在F9～F14代之间进行多重比较显示，生理指标嗜酸性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分数、中性粒细胞、中性粒细胞百分数、淋巴细胞百分数、嗜碱性粒细胞计数、平均红细胞体积、红细胞分布宽度、血小板含量、血小板压积差异有显著性(P< 0.05)；单核细胞百分数、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、平均血小板体积、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、白细胞计数差异有显著性(P< 0.01)，其他指标差异无显著性。糖尿病模型动物具有一定的疾病特征，因此其生理生化指标相比本团队培育的长爪沙鼠近交系，在多项指标如总蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇、血糖、甘油三酯、淀粉酶、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数等都显著升高，而碱性磷酸酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、血小板含量等有所降低[7-8]，其中总蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇等指标与代谢相关，说明在定向进行高血糖筛选的过程中，该模型动物脂代谢和糖代谢受损，符合糖尿病模型动物特征。但是碱性磷酸酶、谷草转氨酶等肝功能相关指标较普通长爪沙鼠近交系较低，其原因有待进一步研究。这些都说明虽然同为新培育的长爪沙鼠近交系，但是本研究中的糖尿病模型群体因其为一个自发性的疾病模型群体，其血液生化和生理指标特征受其内在遗传因素的影响，与其他近交系有显著不同。

本研究针对糖尿病近交系长爪沙鼠这一实验动物资源进行血液生理生化指标的研究，对描绘该模型群体的生物学特征有重要意义。