不同生长年限北五味子植株黑斑病发病规律及生理指标的变化

李嘉丰，许 嘉，任跃英*，常思佳，杨录军，成宜浓

(1.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118； 2.吉林紫鑫红石种养殖有限公司，吉林 通化 135300)

北五味子为多年生木兰科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果实。在我国东北地区，北五味子是重要的药用植物，同时也是重要的经济作物，在长达10～20 a的种植过程中，极易发生黑斑病。艾军等[1]已证实，北五味子黑斑病病原菌为交链孢属(Alternaria)真菌，通常可侵染五味子植株叶片、茎、果实等部位，严重时造成植株枯死，影响植株的生长以及果实的产量，同时在一定程度上也会降低五味子果实的品质。

当植物受到病菌侵染时，体内一系列防御酶活性发生变化，通过对防御酶活性进行测定，可以衡量植株的抗病能力[2-4]。超氧化物歧化酶(SOD)能清除机体新陈代谢中产生的超氧阴离子自由基，维持机体活性氧代谢的平衡。过氧化物酶(POD)可以影响植物体内多种代谢途径，从而在抗病性中起着间接作用[5-7]。多酚氧化酶(PPO)参与酚类化合物的氧化，在植物中能够参与酮类和木质素的合成，抑制病原菌的繁殖和扩张[8]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)主要参与植物中植保素和木质素的合成，前者能直接抑制病原物的生长发育和侵染，后者可以增强细胞壁结构，形成病原菌入侵的机械屏障。本试验选取SOD、POD、PPO、PAL活性和叶绿素含量作为评价抗病性的主要指标，以同一生长环境下不同生长年限北五味子植株为材料，通过对其黑斑病发病率和感染程度进行田间调查，同时对植株叶片进行生理生化指标检测，分析黑斑病的感染规律，为北五味子植株的差异化管理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

以吉林紫鑫红石种养殖有限公司北五味子种植基地的不同生长年限北五味子植株为研究对象。基地位于吉林省通化市柳河县红石镇，拥有北五味子种植园10余处，每个北五味子种植园占地约0.2 hm2，种植密度约为15 000株/hm2。

1.2 田间调查方法

于2017年6—8月在种植基地进行调查，将每个果园划分为4块，每块按照5点法进行取样，每个年限选取100株样本，记录感染黑斑病的植株数量，同时每个生长年限选取10株按下面的叶片分级方法进行调查，按不同的感染级别记录发病情况，结果表示为每100片叶中各病级叶片数量。

叶片分级标准：0级，叶片没有病斑；1级，叶片病斑占叶面积比例为25%以下；2级，叶片病斑占叶面积比例为25%～50%；3级，叶片病斑占叶面积比例为50%～75%；4级，叶片病斑占叶面积比例为75%以上。

按照以下公式计算病情指数：

1.3 生理生化指标的测定

每个感病级别选取叶面积与生长位置基本一致的叶子5片，设3次重复，带回实验室后进行处理，SOD活性测定选择连苯三酚自氧法[9]计算自由基清除率，POD活性测定选择愈创木酚法[10]，PAL活性测定选择L-苯丙氨酸法[11]，PPO活性测定选择儿茶酚氧化法[12]，叶绿素含量测定时去除病斑，选剩余部位进行测定。

1.4 数据分析

使用SPSS 19.0和Excel进行数据统计分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 北五味子黑斑病田间调查结果

2.1.1 植株发病率 随着种植年限的增加，北五味子植株黑斑病发病率前期急剧增加，后期增加速率放缓(表1)。从2年生的13%到4年生的27%，感病植株数量增加107.7%；6年生植株发病率为32%，比4年生植株多出18.5%，比2年生植株多出146.2%。4年生北五味子感病植株对比2年生植株的增加数量>6年生植株对比4年生植株的增加数量。因此，随着时间的增长，黑斑病的发病率会增加，但是增加速度减缓。

2.1.2 叶片感病程度 随着北五味子植株种植年限的增加，健康叶片数量逐渐减少，轻微感病叶片数量明显增加(表1)。2年生北五味子植株叶片中占比最高的是健康叶片，为49.3片，4年生和6年生北五味子植株叶片中占比最高的是轻度染病叶片(1级)，分别为44.6片和46.1片。不同年生北五味子植株健康叶片的数量表现出显著差异， 2年生植株健康叶片数量最多，4年生植株为36.4片，较2年生植株降低26.6%，6年生植株为32.8片，较4年生植株降低9.9%，较2年生植株降低33.5%。2年生北五味子植株的轻度感染叶片数量显著低于4年生植株和6年生植株，后者相比前者分别提升27.06%和31.34%。6年生北五味子植株的重度感染叶片(3级和4级)数量最多，相比4年生植株增加27.5%，相比2年生植株增加58.5%。

随着生长年限的增加，植株叶片病情指数也明显升高(表1)。2年生北五味子植株的叶片病情指数为18.4，显著低于4年生植株和6年生植株,后者相对于前者分别升高22.82%和34.78%，4年生北五味子植株相比2年生植株的病情指数增加量高于6年生植株相比4年生植株的增加量。

综上所述，在北五味子植株多年的生长过程中，黑斑病的发病率和感染程度都呈现增加趋势，生长时间越长，增加的速度越缓慢。植株的生长年限越长，严重感病叶片所占的比例也越高，严重制约了北五味子植株的健康生长。

表1 不同生长年限北五味子植株黑斑病发病率和叶片感染程度调查结果

注：同一生长年限的叶片总数为100片；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 北五味子叶片生理生化指标测定结果

2.2.1 SOD活性 从图1可以看出，SOD活性随着黑斑病侵染面积的增加发生了明显变化，2年生北五味子植株叶片的SOD活性逐渐降低，而4年生植株和6年生植株先增加后降低再增加。2年生植株的最大酶活性出现在未感病叶片，而4年生植株和6年生植株均出现在感染面积25%以下叶片。4年生和6年生植株在相同的感病程度时酶活性之间差异不显著。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同图1 不同生长年限北五味子叶片SOD活性

2.2.2 POD活性 从图2可以看出，随着感染程度的增加，2年生北五味子植株叶片的POD活性先降低后增加再降低，4年生植株叶片酶活性先升高后降低再升高，6年生植株叶片酶活性为先升高后降低。2年生植株的最大酶活性出现在感染面积占25%～50%的中度感染叶片，而另外两者出现在感染面积25%以下的轻度染病叶片，4年生植株在感染面积75%以上时出现第2个酶活性峰值。3种生长年限植株的健康叶片中，2年生植株叶片的POD活性最高，与其他两者存在显著差异。

图2 不同生长年限北五味子叶片POD活性

2.2.3 PPO活性 从图3可以看出，随着感染程度的增加，2年生植株叶片的PPO活性先降低后增加，最大酶活性出现在未感病叶片，而4年生植株和6年生植株的PPO活性先增加后降低，最大酶活性出现在感染面积25%以下的轻度染病叶片，在感染面积达到50%以上时，酶活性降低到与未感病叶片相似的水平。3种生长年限植株的健康叶片中，2年生植株的PPO活性最高，与其他两者存在显著差异。

图3 不同生长年限北五味子叶片PPO活性

2.2.4 PAL活性 从图4可以看出，随着感染程度的增加，2、4、6年生植株叶片的PAL活性均表现为先增加后降低的趋势，在感染面积达到25%以上时酶活性衰减到与未感病叶片相近的水平；三者的PAL活性峰值均出现在感染面积为25%以下时；三者之中，4年生植株叶片酶活性的变化值最大，2年生植株叶片酶活性变化值最小。

图4 不同生长年限北五味子叶片PAL活性

2.2.5 叶绿素含量 通过图5和图6可以看出，随着感染程度的增加，北五味子植株叶片的叶绿素含量呈现下降趋势，但相邻2个感染级别之间没有显著差异；不同生长年限植株的叶片叶绿素含量进行对比，在感染程度较低时2年生植株的叶绿素含量高于4年生植株，在感染程度较高时，其他二者的叶绿素含量高于2年生植株。叶绿素a/b值随感染程度的增加呈现出上升趋势，总体上2年生植株的a/b值低于其他两者。三者在相同感染级别之间不存在显著差异。

图5 不同生长年限北五味子叶片叶绿素含量

图6 不同生长年限北五味子叶片叶绿素a/b值

综上所述，北五味子植株未感病叶片的4种酶活性测定结果中，2年生植株的各种酶活性显著高于其他2种生长年限的植株，更能抵抗病原菌的初期感染；4年生和6年生植株在叶片的感病面积为25%以下时，各种防御酶活性达到峰值，抵抗病原菌的能力最强；POD和PPO活性在感染面积从25%增加到50%的过程中变化不大，其余2种酶活性表现出较大幅度的降低，当感染面积继续增加时，植株体内防御酶活性不足以抵抗病菌侵染所造成的伤害，各种酶活性表现出降低趋势。叶绿素含量的测定结果差异不显著。

3 结论与讨论

植物体内存在的抗氧化酶系统，是植物在逆境胁迫下的重要防御体系之一[13]。SOD和POD能有效清除逆境胁迫下产生的过多活性氧，避免自由基对植物的细胞膜和蛋白质等大分子物质产生破坏作用，从而减轻对植物体的伤害[14]。PPO能使一元酚和二元酚氧化产生醌，对病原菌有抑制和毒杀作用[15]。PAL是植物苯丙烷代谢途径的重要反应酶，而苯丙烷代谢途径产生的多种次级代谢产物对植物的生长有着重要作用，同时在植物抗逆和抗病方面也表现出重要作用，因此也可以作为植物抗逆和抗病的一项重要生理指标[16]。本试验通过对北五味子植株正常叶片与感病叶片进行SOD、POD、PPO、PAL活性和叶绿素含量的测定发现，黑斑病的侵染会造成相关酶活性的显著升高，但叶绿素含量之间的差异并不显著，说明SOD、POD、PPO、PAL的活性可以作为北五味子植株黑斑病抗性研究的参考指标。

当植物受到病原菌侵染后，体内保护酶活性产生变化，当其不足以抵抗病原菌的侵害时，体内酶活性开始降低。通过对不同生长年限北五味子植株健康叶片进行防御酶活性测定发现，2年生植株健康叶片的各种酶活性显著高于4年生和6年生植株，说明2年生北五味子植株在病原菌侵染的初期阶段，能有效抵抗病原菌的侵染。4年生和6年生北五味子植株叶片酶活性峰值出现在感染面积25%以下的叶片，此阶段是防御酶起作用的主要阶段。因此，随着种植年限的逐渐增加，植株防御酶对于黑斑病的主要抗性作用阶段由感染初期转移到感染中期。

对比北五味子植株黑斑病的发病率和感染程度调查结果发现，随着生长年限的增加，北五味子植株黑斑病发病率和感染程度都显著增加，单个植株中各级叶片数量表现为由健康叶片占主体转变为由轻度感染叶片占主体。结合叶片的生理活性变化发现，2年生北五味子植株健康叶片表现出较高的防御酶活性，有助于抵抗黑斑病病原菌的初期感染，因此发病率和感染程度较4年生和6年生植株低。