烟蒜轮作对易感病烟田土壤真菌群落结构的影响

陈玉蓝，林正全，拓阳阳，丁亚茹，李红丽，王 岩

(1.四川省烟草公司凉山州公司，四川 西昌 615000；2.四川省烟草公司凉山州公司宁南分公司，四川 宁南 615400；3.四川省烟草公司凉山州公司德昌分公司，四川 德昌 615500；4.郑州大学生态与环境学院，郑州 450001)

【研究意义】烟草作为重要的经济作物，是凉山州的支柱产业，但是连续耕作使得土传病害越来越严重[1]。土传病害流行是土壤微生物群落结构失衡和恶化的结果，烟草黑胫病、根黑腐病等都是烟田典型的真菌型土传病害。土壤真菌是土壤中的分解者，能够分解土壤中的有机物，为植物提供养分，尤其是土壤中植物残体的降解，是土壤生态系统是否健康的指示物[2]。目前对于土传病害的防治措施主要有物理、化学和生物三大类，相对于物理、化学方法，生物法更安全有效。通过施入抗病微生物等措施可以有效改善土壤微生物结构，提高土壤自身的抗病作用，如假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、青霉属、曲霉属和木霉属等有促进作物生长和拮抗病原菌的功能[3]，也可以通过农业措施改善土壤微生物群落结构，最常用、效果最好的是轮作。轮作模式的差异可改变土壤微生物的生存环境，进而改变土壤环境中微生物的群落结构和活性[4]。【前人研究进展】李星月等[5]研究连作栽培对草莓根际土壤真菌的影响表明，非连作土壤真菌群落丰度和多样性明显高于连作土壤，连作土壤有益真菌减低、病原真菌显著增多。Mao等[6]研究表明连作条件下玉米的生物量和产量会由于土壤微生物的负反馈而降低；Hu等[7]和Liu等[8]研究连作大豆土壤表明减弱了根际土壤真菌群落结构，加强了潜在病原真菌的生长，导致土壤功能退化。轮作具有增强土壤生态系统功能的潜力，对维持农业系统中土壤健康功能至关重要。涂勇等[9]研究发现大豆与烤烟套作显著增加细菌和放线菌的数量，降低烤烟土传病害的发生，且病害的发生与根际土壤细菌和放线菌的数量显著负相关，与真菌数量极显著正相关。阳祥等[10]研究不同轮作模式的土壤真菌群落发现水旱轮作可提高土壤真菌群落的多样性。靳海洋等[11]研究小麦与不同作物多样化轮作对土壤真菌群落的影响，结果表明夏花生或夏大豆替代夏玉米进行不同周期轮作，可增加土壤真菌群落丰富度和多样性，显著影响土壤真菌群落结构，大豆茬口利于有益真菌的富集。因此，更多样化的轮作增加了土壤微生物群落代谢多样性和活性，增加作物产量[12]。【本研究切入点】目前的研究大多只检测了实验室可培养微生物，没有检测土壤微生物群落结构，对于烟蒜轮作或套作土壤的微生物群落结构研究也较少，特别是针对土壤真菌型土传病害的防治方面研究更少。【拟解决的关键问题】本研究利用高通量测序技术，分析健康烟田和烟蒜轮作土壤真菌的群落结构，以及种植大蒜对后期烟草生长根际土壤真菌群落结构和多样性的影响，探讨健康烟田土壤真菌的群落结构特点以及大蒜对烟株根际土壤真菌的影响，为寻找烟草真菌型土传病害有效的生物防治措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 烟田概况与取样

试验田为四川凉山州德昌县凤凰烟站(102°11′17″E，27°25′40″N，海拔1560 m)。健康烟田(往年平均发病率5%)编号为2_1，种烟前空闲，移栽前土壤有机质30.04 g/kg，全氮1.62 g/kg，碱解氮143.50 mg/kg，有效磷88.09 mg/kg，速效钾147.21 mg/kg，pH 5.5。易感病烟田(往年平均发病率为50%)编号为2_2，主要是黑胫病及根腐病混合发病，前茬种植大蒜，移栽前土壤有机质33.11 g/kg，全氮2.16 g/kg，碱解氮163.10 mg/kg，有效磷272.95 mg/kg，速效钾495.17 mg/kg，pH 5.2。分别于烟草移栽前、旺长期和成熟期采土样，按5点取样法，移栽前取5～30 cm土壤，旺长期和成熟期取根际土壤，将土壤混匀取约1 kg，每个试验田取3个平行样，分别编号。每个土样的部分土壤风干过筛用于土壤理化性状及酶活的测定，部分土壤装离心管-20 ℃冷冻保存，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行18S rRNA基因测序和分析。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤理化性质测定方法 按照土壤理化分析方法[13]检测pH、含水率(Moisture content)、有机质(Organic matter)、全氮(Total nitrogen)和土壤养分。

1.2.2 土壤微生物DNA提取及基因测序 根据陈乾锦等[14]研究的DNA提取和测序方法进行18S rRNA基因测序。

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS 22软件进行方差分析。基因测序结果利用上海美吉生物医药科技有限公司I-Sanger云平台进行分析。

2 结果与分析

2.1 根际土壤真菌多样性

Sobs指数显示，移栽前健康和易感病烟田样本呈极显著性差异(图1-a)，健康烟田在移栽前和成熟期之间有显著性差异。从香农(Shannon)指数差异分析(图1-b)可以看出，移栽前健康和易感病烟田之间有极显著差异。Ace指数显示，健康烟田在移栽前和成熟期之间有显著差异(图1-c)。Alpha多样性差异分析显示，在移栽前健康和易感病之间有显著性差异，说明不同前茬对健康和易感病烟田真菌影响较大；健康烟田在移栽前和成熟期之间有显著性差异，说明烟草生长对健康烟田真菌影响较大。

Y2_1和Y2_2为移栽前健康和易感病烟田样本，W2_1和W2_2为旺长期健康和易感病烟田样本，C2_1和C2_2为成熟期健康和易感病烟田样本，*表示0.01

2.2 土壤真菌群落结构

如图2所示，在门水平上(图2-a)，子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、norank_k__Fungi、unclassified_k__Fungi、纤毛门(Ciliophora)和壶菌门(Chytridiomycota)6个菌门的相对丰度超过1%，占总菌数的98%以上。相对丰度含量高于5%的优势菌门有子囊菌门、担子菌门和norank_k__Fungi，总含量在90.80%～94.59%，移栽前和成熟期健康烟田低于易感病烟田，旺长期健康烟田稍高于易感病烟田。子囊菌门都是健康烟田低于易感病烟田，特别是移栽前，移栽前的易感病烟田相对丰度最高，其它时期则是随着烟草的生长都逐渐增加。担子菌门在移栽前健康烟田稍高于易感病烟田，旺长期健康烟田稍低，到成熟期二者趋于一致，即种上烟草后担子菌门减少，健康烟田到成熟期又增加。norank_k__Fungi则在各个时期都是健康烟田显著高于易感病烟田，在此菌门中可能含有抑制真菌性土传病害发生的菌种，即健康烟田特有的菌种。

在纲水平上，相对含量大于1%的有13种(图2-b)，占总菌数的98%以上，其中健康烟田相对丰度高于易感病烟田的优势菌纲是散囊菌纲(Eurotiomycetes)和座囊菌纲(Dothideomycetes)，健康烟田显著低于易感病烟田的是子囊菌纲(Sordariomycetes)。在目水平上(图2-c)，有18种菌相对含量高于1%，占总菌数的95%以上，含量在前5的菌是粪壳菌目(Sordariales)、肉座菌目(Hypocreales)、散囊菌目(Eurotiales)、银耳目(Tremellales)和腔菌目(Pleosporales)，其中易感病烟田相对含量比健康烟田高的有粪壳菌目和 肉座菌目，都属于子囊菌门，健康烟田相对丰度显著高于易感病烟田的有散囊菌目和腔菌目，也都是子囊菌门。在科水平上(图2-d)，有25种菌含量大于1%，占总菌数的94%以上，前5种菌为norank_o__Sordariales、发菌科(Trichocomaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、norank_o__Hypocreales和norank_o__Tremellales，其中易感病烟田相对丰度高于健康烟田的有norank_o__Sordariales、丛赤壳科、norank_o__Hypocreales，低于健康烟田的是发菌科。在属水平上(图2-e)，有27种真菌相对丰度大于1%，占总菌数的93%以上，前5种菌属为norank_o__Sordariales、unclassified_f__Trichocomaceae、镰刀菌属(Fusarium)、norank_o__Hypocreales、norank_o__Tremellales，前4种属于子囊菌门，最后一个为担子菌门。其中norank_o__Sordariales和Fusarium在易感病烟田显著高于健康烟田土壤，在种上烟后都稍有增加，unclassified_f__Trichocomaceae则在健康烟田显著高于易感病烟田，norank_o__Hypocreales在移栽前和旺长期都是易感病烟田高于健康烟田，到成熟期二者相差不大，norank_o__Tremellales在健康烟田和易感病烟田几乎一样。

图2 不同烟田不同时期根际土壤真菌在各个水平上的群落结构

2.3 土壤真菌群落结构Beta多样性分析和差异分析

从图3可以看出，健康烟田和易感病烟田样本之间在横坐标上具有差异性，不同生长期之间在纵坐标上有差异性，移栽前和旺长期相距稍近，差异较小，与成熟期之间相距较远，差异较大。

图3 土壤样本真菌在OTU水平上的主成分分析

健康和易感病烟田土壤真菌群落存在差异，具体分析3个时期前15种土壤真菌在门和属水平上的差异菌种(图4)。移栽前，优势菌门中子囊菌门(Ascomycota)、unclassified_k__Fungi、壶菌门(Chytridiomycota)、纤毛门(Ciliophora)具有极显著差异，子囊菌门和纤毛门在易感病烟田相对丰度极显著高于健康烟田，unclassified_k__Fungi和壶菌门在健康烟田相对丰度显著高于易感病烟田，norank_k__Fungi在健康烟田相对丰度显著高于易感病烟田(图4-a)。优势菌属中noranke_o__Sordariales、unclassified_f__Trichocomaceae、Fusarium具有极显著差异，unclassified_f__Trichocomaceae在健康烟田极显著高于易感病烟田，其余2种在易感病烟田极显著高于健康烟田(图4-b)。说明种植大蒜的易感病烟田土壤有益菌增长，且与健康烟田土壤差异显著。旺长期，优势真菌门在健康和易感病烟田之间没有显著差异菌种(图4-c)；优势菌属norank_o__Hypocreales具有极显著差异(图4-d)，Fusarium具有显著差异，这些菌都是易感病烟田土壤高于健康烟田土壤。成熟期，优势菌门中norank_k__Fungi、unclassified_k__Fungi、Chytridiomycota具有显著差异，且都是健康烟田显著高于非健康烟田(图4-e)。优势菌属中norank_o__Sordariales、Fusarium具有极显著差异，且都是在易感病烟田极显著高于健康烟田(图4-f)。Fusarium是根腐病的病原菌，在烟株生长过程中逐渐增多，健康烟田增加的较慢，移栽前都是最少，说明种植大蒜后的易感病烟田土壤根腐病病原菌的数量减少。

a：移栽前门水平；b：移栽前属水平；c：旺长期门水平；d：旺长期属水平；e：成熟期门水平；f：旺长期属水平

2.4 土壤真菌群落结构与土壤理化性质和酶活的相关性

2.4.1 土壤理化性质和酶活 由表1可以看出，易感病烟田土壤所有理化性质，特别是整个时期的速效磷和移栽前的速效钾都显著高于健康烟田；除了移栽前的pH健康烟田显著高于易感病烟田，旺长期和成熟期的pH都是健康烟田稍高，但没有显著性。

表1 不同时期土壤养分和pH变化

如表2所示，移栽前，健康烟田蛋白酶、蔗糖酶活高于易感病烟田，其余酶活为易感病烟田较高，蛋白酶、脲酶活在健康与易感病烟田之间有显著性差异。旺长期，易感病烟田脲酶活显著高于健康烟田，其余酶活都是健康烟田较高，蛋白酶、蔗糖酶、脲酶活在健康与易感病烟田之间有显著性差异。成熟期，健康烟田土壤的过氧化氢酶、蛋白酶活高于易感病烟田，其余酶活性都是易感病烟田高于健康烟田，除了过氧化氢酶，其余酶活在健康与易感病烟田之间都有显著性差异。从移栽前到成熟期有显著性差异的酶活逐渐增多，说明种植大蒜后减少了健康与易感病烟田之间的差距。整个生长时期，健康烟田的蛋白酶活一直显著高于易感病烟田，脲酶活则一直是易感病烟田显著高于健康烟田，蔗糖酶活在移栽前没有显著性差异，到旺长期开始有显著性差异，在整个生长期逐渐降低，酸性磷酸酶活则是到成熟期才有显著性差异，在整个上涨时期先升高又降低。过氧化氢酶活在移栽前是易感病烟田稍高，从旺长期开始健康烟田稍高，但都不呈显著差异。

表2 不同生长时期烟田土壤酶活性变化

2.4.2 相关性分析 由图5可以看出，酶活与真菌的相关性中，ACP只与norank_o__Sordariales呈显著正相关；CAT与norank_p__Ascomycota呈显著正相关，与norank_o___Sordariales、unclassified_p__Ascomycota呈显著负相关，其余因子都与真菌属呈极显著相关，对真菌的群落结构影响较大，特别是优势菌属。PR与unclassified_o__Pleosporales呈极显著正相关，与unclassified_f__Trichocomaceae、noran_k__Fungi呈显著正相关，与norank_o__Sordariales、假霉样真菌属(Pseudallescheria)呈极显著负相关，与枝孢属(Cladosporium)、unclassified_o__Sordariales呈显著负相关；URE与norank_o__Hypocreales、Fusarium呈极显著正相关，与unclassified_o__Sordariales、unclassified_k__Fungi、枝孢属呈极显著负相关，与unclassified_c__Sordariomycetes呈显著负相关；INV与枝孢属、unclassified_c__Sordariomycetes呈极显著正相关，与unclassified_p__Ascomycota、unclassified_o__Sordariales呈显著正相关，与unclassified_o__Pleosporales、norank_o__Hypocreales、unclassified_f__Nectriaceae呈显著负相关。而理化性质与真菌都呈极显著相关，对优势真菌属影响较大，pH与unclassified_f__Trichocomaceae、noran_k__Fungi、unclassified_k__Fungi呈极显著正相关，与unclassified_o__Sordariales呈显著正相关，与镰刀菌属(Fusarium)、假霉样真菌属、norank_o__Sordariales呈极显著负相关；OM与unclassified_c__Sordariomycetes、枝孢属、假霉样真菌属呈极显著正相关，与norank_o__Sordariales呈显著正相关，与unclassified_o__Pleosporales呈极显著负相关，与norank_o__Hypocreales、unclassified_f__Nectriaceae呈显著负相关；TN与norank_o__Sordariales、假霉样真菌属呈极显著正相关，与unclassified_c__Sordariomycetes、镰刀菌属呈显著正相关，与unclassified_f__Trichocomaceae、noran_k__Fungi呈极显著负相关，与unclassified_o__Pleosporales呈显著负相关；AN与unclassified_c__Sordariomycetes、枝孢属、假霉样真菌属呈极显著正相关，与unclassified_o__Pleosporales呈极显著负相关，与norank_o__Hypocreales、unclassified_f__Nectriaceae呈显著负相关；AK与镰刀菌属呈极显著正相关，与norank_o__Sordariales、假霉样真菌属呈显著正相关，与unclassified_f__Trichocomaceae、

图5 真菌属水平上的群落结构与土壤酶活和理化性质的相关性分析

noran_k__Fungi、unclassified_k__Fungi、unclassified_o__Sordariales呈极显著负相关；AP与norank_o__Sordariales、假霉样真菌属呈极显著正相关，与unclassified_c__Sordariomycetes呈显著正相关，与unclassified_f__Trichocomaceae、noran_k__Fungi、unclassified_o__Pleosporales呈显著负相关。

相对丰度前5的优势菌属中，norank_o_Sordariales与TN、AP呈极显著正相关，与OM、AK、ACP呈显著正相关，与pH、PR呈极显著负相关，与CAT呈显著负相关，unclassified_f__Trichocomaceae与pH呈极显著正相关，与PR呈显著正相关，与AK、TN呈极显著负相关，与AP呈显著负相关，含有病原菌的Fusarium与AK、URE呈极显著正相关，与TN呈显著正相关，与pH呈极显著负相关，该菌属与氮素和氮素转化的脲酶呈显著正相关，与酸碱性呈极显著负相关，烟田酸化利于该菌属的生长繁殖，norank_o__Hypocreales与URE呈极显著正相关，与OM、AN、INV呈显著负相关，norank_o__Tremellales没有相关性的环境因子。

2.5 烟田发病率

如表3所示，调查前一年和调查当年健康烟田发病率均较低，而易感病烟田在调查前一年发病率较高为50.1%，种植大蒜后，发病率降为8.5%，说明种植大蒜可一定程度上降低烟田发病率，主要是种植大蒜改变了土壤的微生物群落结构和微环境，如前分析，种植大蒜增加了有益菌，降低了病原菌，改善了土壤环境因子，进而降低了烟株的发病率。

表3 烟田黑根腐病发病情况

3 讨 论

土传病害病原菌也是土壤微生物群落的组成部分，健康土壤微生物群落一方面可抑制植物病原菌过度地繁殖，另一方面可产生诱导物质诱导植物产生并积累大量次生抗病物质，提高作物的抗病性[15]。易感病土壤微生物群落失衡，某些种类微生物大量繁殖，使土壤微生物多样性降低，而土壤微生物多样性对维持生态系统平衡具有重要作用。随着高通量测序技术的发展，大规模的土壤微生物基因直接测序得以实现，有助于研究土壤微生物的丰富度和多样性，为有效防控土传病害提供理论依据[16]。

本研究发现土壤真菌的总数和多样性有显著差异，在移栽前健康烟田和易感病烟田样本之间的总数和多样性均有极显著差异，前茬对土壤真菌的多样性影响较大，易感病烟田土壤移栽前多样性最高，种上烟后逐渐降低，而健康烟田经过空闲后多样性是2块烟田整个生长期最高的，种上烟后先降低后又增加，说明健康烟田可以自行调节土壤真菌，使多样性逐渐恢复，这与张笑宇等[17]研究相似；而易感病烟田通过种植大蒜使土壤真菌的多样性得到一定的提高[18-19]，改善了土壤真菌群落结构，趋于健康烟田，但种植大蒜没有提高土壤真菌总数，这与阳显斌等[20]的研究结果一致。

优势菌门在移栽前和成熟期健康烟田低于易感病烟田。散囊菌纲在移栽前和旺长期的健康烟田相对丰度显著高于易感病烟田，子囊菌纲则正好相反；与成熟期相比，移栽前土壤，易感病烟田种植大蒜的土壤中散囊菌纲相对丰度降低，座囊菌纲增加，与禚其翠[21]的研究结果一致。优势菌属的镰刀菌属在整个生长时期都是易感病烟田高，且差异显著，但移栽前比旺长期和成熟期低，该菌属为烟草根腐病的病原菌，所以前茬种植大蒜减少了病原菌的数量，非优势真菌属的枝孢属、假霉样真菌属则显著增加，枝孢属主要是腐生菌，可分解植物残体。种植大蒜改变了土壤中真菌群落的组成比例，提高了有益真菌的比例，而降低了有害菌。这与张慧等[22]研究结果相似。

健康烟田和易感病烟田土壤真菌之间有显著差异。移栽前由于前茬作物不同，优势菌门中的子囊菌门、壶菌门和纤毛门有极显著(P≤0.001)差异，子囊菌门和纤毛门在易感病烟分别比健康烟田高15.4%和61.2%，noranke_o__Sordariales在易感病烟田比健康烟田高26.36%，说明种植大蒜有益真菌门增加，有利于土壤真菌群落结构的调整。种上烟草后虽然优势菌门种类不变，但是有差异的菌种与移栽前不同，旺长期只有镰刀菌属具有显著差异，易感病烟田比健康烟田高约56.7%，成熟期则是noranke_o__Sordariales和镰刀菌属有极显著差异，且镰刀菌属比移栽前显著增加，说明易感病烟田种植大蒜后促进烟草根际环境中有益菌的生长，抑制病原菌生长，最终使得这一年的发病率大大降低(仅为6.5%)。

土壤真菌优势菌门与环境因子的分析表明，pH、速效钾和总氮是影响真菌群落变化的主要因子，这与李小林等[23]的研究一致，土壤中包括植物需要的主要养分是由微生物介导的，这些养分也影响着微生物的群落结构组成，杨超等[24]研究认为烟草土壤中真菌与土壤pH、有机质、速效磷、碱解氮和速效钾显著相关，有益菌属与碱解氮显著正相关，烟蒜轮作提高了土壤的碱解氮，这与郭芳阳[25]研究一致，轮作可以提高土壤碱解氮。而且烟草是喜钾植物，钾元素对烟草的生长尤为重要。本研究表明烟蒜轮作与健康烟田空闲土壤相比显著提高土壤速效钾。pH没有显著提高，但是种植大蒜后的烟田土壤pH没有降低，健康烟田稍有降低。norank_o__Sordariales、Pseudallescheria与速效钾显著正相关，这与微生物群落组成结果一致，移栽前这些菌种在种植大蒜后的土壤中显著增加。但改善真菌群落结构提高烟株抗病的机理研究，还需要进一步比较分析烟草根际微生物种群的代谢变化才能真正揭示。

4 结 论

本文比较研究了易感病烟田前茬种植大蒜后于健康烟田土壤真菌的群落结构变化，以及于土壤养分、pH、有机质和酶活性的相关性。

(1)移栽前，种植大蒜的易感病烟田子囊菌门和担子菌门优势真菌相对丰度高于健康烟田，镰刀菌属(Fusarium)等病原真菌相对丰度虽然高于健康烟田，但比烟草生长时期已显著下降。

(2)移栽前易感病烟田的真菌多样性最高，种植大蒜提高了易感病烟田土壤有益真菌的种类和多样性，且降低了病原菌的相对丰度，使发病率由往年的50.15%降到8.57%。

(3)种植大蒜可改变易感病烟田土壤真菌的群落结构，使其趋于健康烟田。