北苍术根腐病植株根际土壤真菌群落多样性分析

高鑫媛，赵红玲，白茹玥，李 哲，魏金月，赵蓝青青，赵春颖

(承德医学院/河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

【研究意义】苍术为菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎[1]，是常用的中药材，其主要活性成分为苍术素、β-桉叶油醇、苍术酮等[2]，临床上具有抗肿瘤[3]、调节肠胃[4]、抑制胆固醇合成[5]和免疫调节[6]等作用，并在治疗新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 19，COVID-19)中起到重要作用[7]。近年来，野生北苍术逐渐减少，栽培北苍术药材在市场上的占有率不断升高，北苍术的野生变家种已成为必然趋势，但在栽培的过程中遇到许多的土传病害问题，其中根腐病较为严重。北苍术植株根腐病初期的表现为叶片变黄、枯萎，随之根茎开始腐烂，呈黑褐色，并散发的异味。有研究表明，根腐病是中药材生长过程中最为常见的土传病害，其具有极大危害性[8]。导致中药材根腐病的原因较为复杂，包括土壤酸碱度、温度、湿度及植物连作等[9-10]。植物连作可导致植物根际土壤中的微生物群落结构发生变化，而微生物群落又是土壤的重要组成部分，在代谢循环、生长发育、抗病性、非生物胁迫耐受性及合成促生激素等方面发挥着不可或缺的作用[11-12]。真菌被认为是植物患根腐病的主要原因之一[13]，人参的根腐病致病菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)[14]；三七的根腐病致病菌为茄腐镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌等[15-16]。因此，研究北苍术患根腐病植株与健康植株根际土壤真菌的多样性，探索两者之间的真菌群落结构的变化，可以给解决北苍术植株的根腐病问题提供理论依据。【前人研究进展】郭兰萍等[17]提取了一至二年生栽培茅苍术根际土壤微生物的DNA，运用ARDRA(amplified rDNA restriction analysis)技术对真菌进行了鉴定与比较，发现二年生茅苍术根际土壤中真菌相比一年生降低49.25%，所以判断生长多年的茅苍术发生病虫害多，可能与根际土壤微生物的数量及群落的变化有关。【本研究切入点】有关北苍术植株患根腐病的根际土壤微生物的多样性尚未研究，差异菌群的功能多样性与北苍术植株根腐病根际土壤理化性质及土壤酶活的互作关系尚待验证。【拟解决的关键问题】利用高通量测序技术(High-throughput sequencing)[18-20]分析北苍术根腐病与健康植株根际土壤微生物群落组成与变化特征，并对土壤理化性质与酶活性进行了定量分析，旨在了解北苍术根腐病发病机理和为防治北苍术根腐病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 根际土壤样品采集

土壤样品2020年10月采集于河北省承德市隆化县韩家店村(北苍术种植基地科研实验基地，海拔：858.18 m；117°24′43″E，41°34′57″N)。随机选取二年生北苍术根腐病植株根际土壤及健康植株根际土壤分别记录为CB和CJ。所选取的植株经承德医学院赵春颖教授鉴定为北苍术。每个处理3次重复。取附着于根系的土壤作为根际土壤，装入自封袋，低温运输至实验室，将采集的土壤过80目筛，去除土壤根系枯叶等杂质，分为2份，1份用于提取土壤微生物DNA，在-80 ℃条件下贮藏，1份用于检测土壤酶活和理化性质。

1.2 土壤理化性质及酶活的测定

使用土壤速测仪进行土壤速效N、速效P、速效K及土壤pH的测定(PR-3001-TRREC-N01 壤博士土壤检测仪)。使用土壤碱性磷酸酶(S-AKP)试剂盒(BC0280 Solarbio)，土壤脲酶(S-UE)试剂盒(BC0152 Solarbio)，土壤蔗糖酶(S-SC)试剂盒(BC0240 Solarbio)按照说明进行土壤酶活的测定，酶标仪(S/N 601-0725 BMG LABTECH 德国)。

1.3 土壤微生物DNA提取

使用E.Z.N.A.®土壤DNA试剂盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)提取土壤样品微生物总DNA，DNA提取液在1%琼脂糖凝胶上检测提取质量，DNA浓度和纯度用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，USA)测定。

1.4 土壤真菌 ITS 序列的 PCR 扩增及高通量测序

采用真菌通用引物[ITS1FCTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA/ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)]扩增。通过ABI GeneAmp®9700 PCR热循环仪(ABI，CA，USA)扩增真菌ITS区域。PCR产物使用AxyPrepDNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)进行纯化并使用定量TM荧光计(Promega，USA)进行定量。

1.5 文库制备与上机测序

采用Illumina 公司制备测序文库，构建的测序文库经检测合格后，使用Illumina Miseq平台测序(委托上海美吉生物医药科技有限公司完成)。

1.6 数据处理与分析

测序数据用fastp 0.20.0[21]对原始Reads进行质控过滤，用FLASH 1.2.7[22]进行合并，使用Uparse(version 7.1.)对97%相似水平下的操作分类单元(OTU)进行生物信息统计分析。用RDP分类器2.2版[23]基于Unite(Release 8.0 http://unite.ut.ee/index.php)真菌数据库及0.7的置信度阈值对每个OTU代表序列的分类进行分析，并分别在各个分类学平：门(Phylum)，纲(Class)，目(Order)，科(Family)，属(Genus)，种(Species)统计各样本的群落物种组成。选择97%相似度的OTU或其他分类学水平，利用mothur(version v.1.30.2 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)进行稀释性曲线(Rarefaction curve)分析，R语言工具制作曲线图。基于Chao1、Sobs、Shannon、Coverage指数估计群落Alpha多样性，并运用统计学T检验进行组间差异检验。基于主坐标分析PCoA(Principal co-ordinates analysis)及物种组成heatmap图和样本聚类树来阐明不同样本组成的差异性。使用SPSS 26.0及Origin 2021进行数据相关性分析。

2 结果与分析

2.1 苍术根际土壤中真菌多样性分析

2.1.1 Alpha多样性分析 在质控后共得到463 991条ITS2序列，序列平均长度为240 bp。抽平分析后，每个样本包括70 223条序列，共产生2538个OTUs。其中444个OTUs为根腐病北苍术植株根际土壤样品所有，574个OTUs为健康北苍术植株根际土壤样品所有，760个OTUs为样品共有(图1)。

图1 不同北苍术植株根际土壤的真菌群落的OTUs

以抽取的数据量为横坐标，以Alpha多样性指数值为纵坐标绘制稀释性曲线(图2)。曲线逐渐趋于平缓，说明获取的Reads可以代表真菌群落的多样性。通过计算丰富度指数(Chao1、Sobs)、辛普森指数(Simpson)、香农指数(Shannon)、覆盖率(Coverage)等估计群落Alpha多样性(表1)。根腐病北苍术植株根际土壤的Shannon、Chao1及Sob指数值低于健康土壤，Simpson 指数高于健康土壤，说明根腐病北苍术植株根际土壤中真菌群落丰度低、多样性小。并且利用统计学T检验方法，检测不同处理中真菌群落的差异性，结果显示2个处理之间Chao1与Sobs指数无显著差异，其余P值均≤0.05，说明这根腐病北苍术植株根际土壤于健康植株根际土壤之间真菌群落的多样性具有显著性差异。

图2 北苍术土壤样本的真菌群落基于OTU水平的稀释性曲线

表1 北苍术植株根际土壤真菌群落的Alpha多样性指数统计

2.1.2 Beta多样性分析 为能更直观地反映不同处理间的差异程度，对样本数据进行PCoA主成分分析，基于 Bray-Cruits 相异度距离反应不同处理差异性。如图3所示，样品点的排布代表了样品之间的相异程度。CB主要分布在PC1及PC2轴的负端，CJ主要分布在PC1轴的正端及PC2轴的负端，两者可明显区分。

图3 不同北苍术根际土壤的真菌群落基于OTU水平的PCoA分析

对不同土壤样本真菌群落属水平物种组成Heatmap图和样本聚类树进行分析，不同样本中TOP 50真菌群落属类存在差异(图4)，其中Heatmap图中色块颜色代表某一个属相对丰度的大小，且将6个样品聚为2支，CB与CJ样品明显分开，表明CB与CJ样品优势属组成存在差异。

图4 不同北苍术根际土壤真菌群落属水平物种组成和样本聚类树

2.1.3 LEfSe多级物种差异辨别分析 利用LEfSe差异分析，筛选出不同处理的北苍术植株根际土壤中具有显著差异的微生物(LDA阈值为4)。由图5可知，与CJ相比，CB样本中子囊菌门(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、Netriaceae、赤霉属(Gibberella)等显著聚集。然而在CJ样本中散囊菌纲(Eurotiomycetes)、暗壳腔菌科(Phaeosphaeriaceae)、Setophoma、Chaetothyriales、粪壳菌科(Sordariales)等菌群富集。

图5 不同北苍术根际土壤真菌群落多级物种差异辨别分析

2.2 苍术根际土壤中真菌组成分析

2.2.1 门水平群落结构分析 在北苍术植株根际土壤样品中共检测到真菌10门42纲93目208科412属669种。如图6所示，子囊菌门(Ascomycota)、被孢霉亚门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)为优势菌门。患有根腐病的北苍术植株根际土壤及健康北苍术植株根际土壤中子囊菌门的丰度最高，分别为75.81 %、69.94%。其次为孢霉亚门，在根腐病北苍术植株的根际土壤中占比为14.22%，健康植株根际土壤中占17.48%。担子菌门、壶菌门在根腐病北苍术植株根际土壤中分别占6.44%、1.10%，在健康北苍术植株根际土壤中分别占6.88%、1.83%。

图6 不同北苍术根际土壤真菌门水平真菌群落结构

2.2.2 纲水平结构群落分析 如图7所示，粪壳菌纲(Sordariomycetes)的相对丰度排在根腐病北苍术植株根际土壤及健康植株根际土壤的首位，其相对丰度的占比分别为45.21%、38.00%，差异较明显。座囊菌纲(Dothideomycetes)的相对丰度在根腐病北苍术植株根际中为18.56%，健康植株根际土壤中占比为16.20%。而排名第三、四、五的Mortierellomycetes、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、Tremeiomycetes在2组样本中的相对丰度均为健康植株根际土壤中占比高于根腐病植株根际土壤。这三个菌在健康植株根际土壤中比根腐病植株根际土壤分别高3.26%、4.89%、2.24%。其余的Leotiomycetes、伞菌纲(Agaricomycetes)、盘菌纲(Pezizomycetes)在这两组处理中的相对丰度没有明显的差别。

图7 不同北苍术根际土壤真菌纲水平真菌群落结构

2.2.3 目水平群落结构分析 在这2组样本中排名前十的目水平丰富度均有差异(图8)，肉座菌目(Hypocreales)在根腐病植株根际土壤和健康植株根际土壤中均为优势种群，相对丰度较大。假球壳目(Pleosporales)在根腐病植株根际土壤的占比17.17%，而在健康植株根际土壤中占比15.28%，相差不大。排名第三的被孢霉目(Mortierellales)及排名第四的粪壳菌目(Sordariales)、排名第六的散囊菌目(Eurotiales)、排名第八的刺盾炱目(Chaetothyriales)、排名第九的线黑粉菌目(Filobasidiales)也均在健康植株根际土壤中占比高。排名第五的Microascales在根腐病植株根际土壤中土壤中占比高于健康植株根际土壤，在根腐病根际土壤中占比为5.77%，健康土壤中占比4.13%。排名第七的小丛壳目(Glomerellales)在根腐病土壤中占比高于健康土壤。由此可见，根腐病北苍术植株根际土壤中真菌目水平的相对丰度较高的为：肉座菌目(Hypocreales)、假球壳目(Pleosporales)、Microascales、小丛壳目(Glomerellales)。健康土壤中真菌目水平的优势群落为：被孢霉目(Mortierellales)、粪壳菌目(Sordariales)、散囊菌目(Eurotiales)、刺盾炱目(Chaetothyriales)、线黑粉菌目(Filobasidiales)。

图8 不同北苍术根际土壤真菌目水平真菌群落结构

2.2.4 科水平群落结构分析 丛赤壳科(Nectriaceae)的相对丰度在根腐病土壤中占比最高为18.48%(图9)。被包霉科(Mortierellaceae)相对丰度在健康土壤中占比最高为17.44%。小双腔菌科(Didymellaceae)在根腐病土壤和健康土壤中相对丰度差异较小，Plectosphaerellaceae菌在健康土壤中相对丰度较高分别为19.85%、12.81%。Chaetothyriaceae、Lasiosphaeriaceae、Piskurozymaceae在根腐病土壤中相对丰度较健康土壤中低，分别为5.62%、2.05%、1.94%。在这2个北苍术土壤样本中，排名前十的丛赤壳科(Nectriaceae)、Microascaceae、Plectosphaerellaceae、Trichocomaceae在科水平相对丰度群较健康土壤中丰度高。

图9 不同北苍术植株根际土壤真菌属水平真菌群落结构

2.2.5 属水平群落结构分析 如图10所示，从属水平分析，在根腐病北苍术植株根际土壤中镰刀菌属(Fusarium)，赤霉属(Gibberella)丰度较健康土壤高，分别为9.50%、7.57%。在北苍术的健康土壤中被孢霉属(Mortierella)、亚隔孢壳属(Didymella)、毛壳属(Cheatomium)、Solicoccozyma、Kernia、Penicillium等菌群丰度相对于根腐病植株根际土壤的群落占比高分别为17.55%、6.67%、4.93%、3.39%、3.49%、3.26%。在本次分析中发现Tausonia为苍术健康的根际土壤菌群，在根腐病植株根际土壤中没有发现。Monodictys、Neocosmospora、Althrnaria、Gibellulopsis等菌群在苍术健康土壤中亦未发现。

图10 不同北苍术植株根际土壤真菌属水平真菌群落结构

2.3 真菌群落与土壤理化性质及土壤酶活分析

2.3.1 不同土壤的理化性质及土壤酶活 由表2可知，CB中速效N、速效K和速效P显著高于CJ。且相比CJ，CB的pH显著降低，而水分含量及电导率显著升高。在土壤的酶活检测中，CJ处理组的酶活与CB处理组的酶活存在显著性差异，CJ处理的S-AKP、S-UE、S-SC值显著低与CB处理。

表2 不同样本的土壤的化学性质

2.3.2 不同土壤的真菌群落与土壤酶活的相关性 选择真菌群落属水平的排名前十的菌群与土壤酶活进行相关性分析(图11)。北苍术植株根际土壤的pH与水分，速效N及3种土壤酶活含量呈显著负相关，相关系数为-0.98、-0.936、-0.895、-0.954，与Kernia、Penicillium、Schizothecium、Setophoma的含量呈显著正相关。土壤水分与土壤脲酶含量呈显著正相关，与被孢霉属(Mortierella)、Penicillium、Schizothecium、Setophoma含量呈显著负相关，相关系数为-0.967、-0.954、-0.972、-0.820。毛壳属(Cheatomium)的含量与速效P、速效K呈显著负相关，相关系数为-0.816。Setophoma属含量与Solicoccozyma属、Kernia属、Schizothecium属呈显著正相关，相关系数为0.945、0.887、0.890。镰刀菌属(Fusarium)、亚隔孢壳属(Didymella)、赤霉属(Gibberella)与土壤理化性质及酶活没有显著的相关关系。

*.在 0.05 水平(双侧)上显著相关

3 讨 论

本研究采用高通量测序技术对二年生的根腐病北苍术植株根际土壤及健康北苍术植株根际土壤根际真菌群落多样性进行初步研究，共获得其根际在不同分类级别的优势分类群的总数及其相对丰度，包括门、纲、目、科、属、种等。二年生根腐病北苍术植株根际土壤的真菌群落的多样性及丰富度都低于健康北苍术植株根际土壤真菌落，与茅苍术根际微生物的变化相同[15]。

研究表明，子囊菌门和担子菌门的微生物是主要的土壤真菌分解者[26]，在本研究中，所有土壤样本中子囊菌门和担子菌门的相对丰度最高，镰刀菌能刺激植株内酚酸物质的积累，导致植物死亡[27-28]，酚酸类物质能调节土壤微生物群落，促进致病菌的增值，减少有益菌[29]，也有实验证明尖孢镰刀菌为白术的主要致病菌[30]，本次研究发现根腐病北苍术植株根际的土壤中丰度增多的菌群含有镰刀菌，根腐病北苍术植株根际土壤中的子囊菌门占9.50%，也从侧面印证了该结论。吴小强等[31]运用高通量测序技术对不同生长年限的苍术健康植株根际土壤微生物进行分析，发现随着种植年限增长，Tausonia属丰度降低，本研究中在健康植株土壤中发现Tausonia属的相对丰度为1.77%，在根腐病土壤中未发现。毛壳菌是一类重要的资源真菌，作为生防菌对植物病原菌具有很好的防治效果[32]，该类真菌含量与土壤的pH呈显著相关，在健康土壤中含量较多，在根腐病土壤中含量较少。Setophoma属被认为是黄精根茎中的优势内生菌属[33]，在健康北苍术植株的根际土壤中丰度也比根腐病植株根际土壤中丰度高。Solicoccozyma属在重楼的健康植株根际土丰度占比较高[34]，Kernia属是番茄的致病菌[35]，但是在健康北苍术植株根际土壤中丰富高于根腐病植株根际土壤，说明此类菌可能不是北苍术植株患根腐病的主要致病菌，亦或者其他的生防菌对该菌属起着抑制作用。特殊生境中的Schizothecium菌对促进宿主植物生长，提高耐受及环境胁迫能力等方面都发挥了重要影响[36-37]，本研究发现该菌群在健康北苍术植株根际土壤中丰度亦相对高。所以北苍术根腐病的发生和以上菌群的增加或减少可能有着一定联系。但是要明确这些菌群对北苍术根际土壤中真菌是促生或抑制，后续课题组将进一步进行验证。

土壤pH可以影响土壤的所有化学，物理和生物特性，也是影响根际土壤微生物群落组成的主要因素[38]。本研究中，根腐病北苍术植株根际土壤的pH小于健康土壤。当pH小于6时，土壤微生物的群落多样性会随着pH的降低而减少[39]。本研究发现在根腐病植株根际土壤中的速效N、速效P、速效K及含水量都高于健康植株根际土壤，分析是植物根的腐烂导致植株吸收水分能力减弱，土壤含水量增加，长时间的根腐病侵染会降低植株的活力和土壤微生物生物量，改变真菌群落组成和土壤功能，使其向更快的有机碳分解方向发展，这可能会增加土壤有机质的消耗[40]。根腐病植株根际的土壤电导率高于健康植株根际土壤，表明根腐病可以导致细胞膜透性的增大，离子外渗量增加，细胞膜的完整性可能已经被破坏[40]。要反应土壤的质量，酶活亦是重要指标[24]。在生理代谢过程中，土壤酶活性增强可以加速有机物含量的增加，给与微生物生长的养分，促使微生物的繁殖速度加快[41]。结合Acostamartinez等[42]、Liu等[43]研究证明：碱性磷酸酶是影响药用植物连作的一种关键的胞外酶，与微生物群落结构和组成的变化密切相关。在本次实验中，发现土壤碱性磷酸酶活性与土壤pH呈显著相关性。可判断这可能亦是北苍术患根腐病原因之一。

4 结 论

在北苍术植株根际土壤微生物真菌群落丰度的研究中，常见生防菌毛壳属(Cheatomium)在根腐病北苍术植株根际土壤中占比较少，Schizothecium菌在健康北苍术植株根际土壤中占比丰度更高。常见致病菌镰刀菌(Fusarium)在根腐病北苍术植株根际土壤中占比多。在北苍术的栽培过程中，为了降低北苍术植株患根腐病的发病率，可以结合北苍术健康植株根际土壤的微生物真菌群落丰度及土壤理化性质与酶活的改变，对根腐病植株的根际土壤微生物的群落结构进行改善，从而减少北苍术患根腐病的情况。但是，目前可以寻找到的指示菌是否能够真正用于指导病害发生检测和生防调控，还必须深入、全面地研究和验证。