镉胁迫下根际促生菌对紫花地丁生长和镉含量的影响

杨明洁，张晓曼，赵 蔓

(河北农业大学，河北 保定 071000)

【研究意义】土壤生态系统中重金属水平的持续上升是全世界关注的主要问题。技术的进步导致在环境中引入重金属污染物[1-2]，重金属污染具有隐蔽性或潜伏性[3]，是一个相当长的逐步积累的过程，且不易被发现，土壤一旦遭到污染后极难恢复[4]。重金属污染是一个不可逆过程且具有长期性。为了解决有毒重金属的毒性威胁，清除土壤中有毒重金属，利用植物—微生物联合去除、破坏或隔离污染环境中的重金属是一种高效、安全、廉价和环境友好的方式[5]。【前人研究进展】根际促生菌(PGPR)促进重金属土壤中植物的生长，因为根际土壤中存在有效的微生物活性，接种PGPR可以活化重金属，提高金属提取效率[6]。耐镉菌株通过细胞壁表面的化学集团吸附重金属离子，形成络合物降低重金属迁移率，进行胞外沉淀从而达到去除土壤中重金属的目的[7]，研究表明铜绿假单胞菌和芽孢杆菌可以修复Zn和Cu土壤[8]。芽孢杆菌对重金属Cd也有较好的吸附效果，在土壤镉修复具有较大的研究价值。枯草芽孢杆菌分泌的碳水化合物、脂质、多糖和蛋白质可以提高菌体对镉的耐受性，目前研究人员多关注不同培养条件下枯草芽孢杆菌的镉吸附效果[9]。枯草芽孢杆菌浇灌到无菌土中定殖菌体数逐渐升高并趋于稳定[10]，使植物的根长、地上部长度、植株鲜重和干重的增加[11]。铜绿假单胞菌对重金属去除效果良好[12]，尤其对镉具有较高的耐性，Lin等[13]分离得到的铜绿假单胞菌对镉的耐受性浓度高达2200 mg/L。【本研究切入点】大部分重金属在土壤中的生物有效性较低，能被植物利用的部分很少[14]，超富集植物能够强烈活化和溶解根际环境的难溶态重金属，具有超常的吸收转运和富集重金属的能力[15]，但超富集植物大多观赏性较差，栽培管理受到一定限制。紫花地丁作为早春开花植物，生长迅速，适应性强，栽培范围广，对栽培管理不严格，且具有良好的景观效果，在Hg汞矿废弃区具有一定的耐性[16]，具有一定的修复重金属应用潜能。【拟解决的关键问题】通过分析不同镉浓度下，接种不同根际促生菌对紫花地丁的生物量、根系形态、氮磷钾含量以及根系重金属镉的吸收等，研究重金属镉胁迫下促生菌对紫花地丁的交互影响，为重金属污染下的园林绿地种植应用草本花卉提供基础理论。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以堇菜科多年生草本植物紫花地丁(Violaphilippica)为供试材料，盆栽试验中，以m(园土)∶m(沙)∶m(草炭土)=2∶2∶1混合，121 ℃高压灭菌1 h，将灭菌土壤与CdCl2溶液混合，直至与土壤均匀混合达到1、10、100 mg/kg，放置7 d进行重金属稳定。供试菌株PACC6633枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、PACC9027铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由北京生物保藏中心提供，采用Nutrient Broth(NB)培养基37 ℃培养24 h后于4 ℃保藏备用。

1.2 菌种菌悬液的制备

取1 mL枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌液接种于经过高温高压灭菌的100 mL NB液体培养基中，置于摇床中37 ℃，200 r/min下扩大培养24 h。取10 mL菌悬液在5000 r/min 下离心10 min，弃上清液，用10 mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤、沉淀多次以除去残余的培养基[17]。用10 mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释为波长 600 nm、吸光度0.8的菌悬液(菌液浓度约为108CFU/mL)备用。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 试验于2020年10—12月在河北农业大学园林与旅游学院智能温室进行。试验为双因素处理，因素一为Cd浓度，包括0(CK)、1(L)、10(M)、100 mg/kg(H)4个水平；因素二是促生菌的不同接种种类，设置接种枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌混合菌以及不接菌4个水平，播种在含有1.5 kg灭菌基质的花盆(直径21 cm，高16 cm)中, 间苗至3 株每盆，每个处理重复5次，共80 盆。花盆底下垫上细砂网防止土壤以及重金属的淋失，托盘下面再放一层塑料薄膜。接菌形式采用灌根法，在植物根际接入20 mL菌悬液(108CFU/mL)，不接菌的施入20 mL经高温灭菌处理的菌液，在自然光照温度25 ℃下进行，生长过程用去离子水每天浇灌(水中未检测出其它重金属)。

1.3.2 株高、生物量的测量 镉胁迫处理60 d试验结束，在收获前测量紫花地丁的株高，在收获时，用自来水彻底冲洗植物体，去离子水漂洗吸干水分后，将地上和地下部分开，用于生物量的测定。

1.3.3 根系形态的观察和测定 采用LA-S植物根系分析仪对紫花地丁的根系图像扫描，使用LA-S根系生长监测系统图像分析系统测定根长、根系表面积、根尖数、根系分叉数和根直径。

1.3.4 植物N、P、K含量的测定 将分开的地上和地下部分自然晾干后放入恒温干燥箱于105 ℃下杀青20～40 min，然后在80 ℃下烘至恒重。取烘干后的植物样品放入研钵中进行研磨处理得到植物样粉末，过100目筛，采用浓H2SO4消解。全氮用全自动凯氏定氮仪测定；全磷含量用钼锑钪比色法测定，全钾采用原子吸收分光光度计测定(津岛AA-6800)。

1.3.5 植物地上和根系镉吸收量的测定 烘干并过筛的植物粉末，采用浓HNO3-HClO4法(HNO3、HClO4均为优级纯，二者体积比(4∶1)消解，并用原子吸收分光光度计(津岛AA-6800)测定镉含量。

1.4 数据处理

试验所测数据用 Microsoft Excel 2016 进行数据整理，用 SPSS 22.0 进行单因素方差分析(ANOVA)、双因素方差分析(ANOVA)、邓肯多重极差检验比较处理间的差异，P<0.05 差异显著，数据以平均值±标准差表示。利用Canoco 5 进行PCA主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Cd对紫花地丁株高和生物量的影响

由图1可看出，Cd胁迫显著抑制了紫花地丁株高的增加、地上生物量和地下生物量的积累，接种菌促进了紫花地丁的生长。随着Cd浓度升高，对紫花地丁株高增幅的抑制也随之增加；不接菌的处理下，Cd浓度为100 mg/L时株高增加量最低，比CK降低了17.6%。接菌后，当Cd浓度为0、1、10 mg/L时比CK高1.3%、5.1%、6.4%，Cd浓度为10 mg/L时对株高增加量影响最显著。原因可能是接种后的菌株对Cd有一定的耐性，根际土壤微生物存在有效的微生物活性，激发ACC脱氨酶活性，水解合成乙烯前体ACC，降低乙烯水平，减轻了重金属对植物的毒性[18]。

图中数据为平均值±标准差，n=5；CK，对照；不同小写字母分别表示不同镉浓度处理间在0.05水平存在显著性差异(P<0.05)

不同浓度的Cd处理下，地上生物量比CK的降幅依次为31.1%、32.5%、69.2%，各处理均显著低于CK，当Cd浓度为100 mg/L时，地上生物量降幅最大，生长受到明显的抑制，接种处理后地上生物量在0、1、10 mg/L分别增加3.4%、12.5%、20.2%，Cd浓度为100 mg/L时增加量最低，且与其他处理存在显著差异。这与Zhang等[19]研究结果一致，原因是重金属的存在对促生菌生长存在一定的毒性，重金属浓度越高抑制越强烈。研究表明，当Cd胁迫达到200 mg/L时，几乎没有微生物，接菌后重金属毒性强，促生菌活性降低，缓解重金属对植物的危害效果不明显。

不同浓度的Cd对紫花地丁地下生物量的影响表现出双重性，1 mg/L Cd胁迫降低了紫花地丁的株高和地上生物量增幅，但提高了地下生物量增幅，说明在低浓度的Cd胁迫下紫花地丁在生长过程中表现出一定的耐受性，能够促进紫花地丁地下部分生长，但随着Cd浓度升高，地下生物量逐渐受到抑制。不接种的地下生物量降幅均存在显著差异。接种处理后地下生物量增幅依次为10.2%、33.5%、66.6%、31.1%，Cd浓度为10 mg/L时增幅最高。

表1 镉胁迫下促生根际菌对根长、根表面积和根直径的交互作用

表2 交互作用对紫花地丁根系形态的影响

2.2 交互作用对紫花地丁根系形态的影响

Cd胁迫和接种促生菌对根系长度、根系表面积和根直径存在交互影响(表1～2)。与对照相比，总体上Cd处理对PA接菌中根系表面积和根长有显著的促进作用，混合接菌对根直径没有显著影响。随着Cd浓度的增大，根系表面积呈现下降趋势。在不受Cd胁迫条件下，根长由大到小排序为PA接菌、BS接菌、不接菌、混合接菌(P<0.05)，根系表面积和根直径由大到小排序为PA接菌、混合接菌、BS接菌、不接菌(P<0.05)，根系表面积的接菌处理显著高于未接菌且PA接菌显著高于BS接菌(P<0.05)。在不同浓度Cd处理组中，根长由大到小排序为混合接菌、PA接菌、不接菌、BS接菌，根系表面积和根长在H组由大到小排序为PA接菌、混合接菌、不接菌、BS接菌(P<0.05)，根系表面积在处理组下也呈现接菌处理显著高于未接菌处理。

Cd处理对PA接菌中根系表面积和根长有显著的促进作用，说明接种铜绿假单胞菌可促进植物在重金属胁迫环境下增加紫花地丁根系生长和表面积，从而增加吸收水分与营养物质，进而增强植物抗性[20]，且在高浓度镉胁迫下也有同样作用。随着Cd浓度的增加，混合接菌对根系长度的促进效果最好，也能增加重金属的有效根表面积，促进重金属的吸收、转运和积累。

Cd胁迫和接种促生菌对根尖数和根分叉数交互作用不显著，因此对差异显著的主效应进行分析，接种促生菌对根尖影响显著。如图2所示，不接菌处理的根尖数为530，BS接菌的根尖数为498，PA接菌的根尖数为822，混合接菌处理的根尖数为632。PA菌接菌显著高于BS菌接菌。不同浓度的Cd处理对根分叉数影响显著。不受镉胁迫的条件下根分叉数为717，L处理下根分叉数为898，M处理下根分叉数为680，H处理下根分叉数为669。促生菌接种对根尖影响显著，接种后的促生菌存在于植物根系周围，并与植物结合，改善了根系在土壤中的分布从而有更多的根系定殖点[21]。100 mg/L的Cd处理时根分叉数显著降低，说明高浓度的镉易被植物吸收并积累，超过一定程度时会对植物产生毒害作用[22]。

图中数据为平均值±标准差，n=5；不同小写字母分别表示不同接菌处理间在0.05水平存在显著性差异(P<0.05)，不同大写字母分别表示不同镉浓度处理间在0.05水平存在显著性差异(P<0.05)

2.3 交互作用对紫花地丁全氮、全磷、全钾的影响

如表3所示，不同接菌处理对紫花地丁地上部分的全氮、全磷、全钾影响不同。全氮由大到小排序为混合接菌、PA接菌、BS接菌，全磷和全钾由大到小排序为PA接菌、BS接菌、混合接菌，随着Cd处理浓度的增加，与不受镉胁迫处理相比，接菌处理后紫花地丁地上部分全氮先增后降，平均增幅L处理为8.60%，M处理为12.58%，H处理为10.39%。地上部分的全磷下降，平均降幅L处理为11.15%，M处理为12.85%，H处理为9.63%。地上部分的全钾先增后降，平均增幅L处理为2.57%，M处理为0.28%，H处理为9.63%。

表3 交互作用对紫花地丁全氮、全磷、全钾的影响

接菌处理后紫花地丁地下部分全氮大致增加，平均增幅L处理为3.81%，M处理为17.60%，H处理为16.58%。地下部分的全磷先增后降，平均增幅L处理为1.21%，M处理为8.18%，H处理为7.60%。地下部分的全钾先增后降，平均增幅L处理为2.60%，M处理为9.42%，H处理为8.98%。

总的来说，L和M处理中混合接菌地上部分全氮最高，而H处理的PA接菌地上部分全氮最高。在L、M、H处理下PA接菌的地下部分全磷最高。表明铜绿假单胞菌可以通过将土壤中难以利用的物质转换为植物可利用的形态，提高植物可利用的磷元素水平[23]，且在土壤高浓度Cd胁迫下依旧产生作用。

根际促生菌提高植物对重金属的抗性，促进植物对氮等营养物质的吸收，提高植物的生物量，增加植物从土壤中吸收重金属的总量。本试验中，接种枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌混合菌对植物地上和地下部分全氮影响最大，提高了紫花地丁的营养元素的含量，特别是显著地提高紫花地丁植株的固氮能力[24]。由此可以得出，接种促生菌之后在植物对抗镉胁迫的过程中，混合菌起到至关重要的作用。

2.4 紫花地丁重金属镉含量

如图3所示，不同接菌种类对Cd胁迫下对紫花地丁镉含量的影响。当Cd浓度为1 mg/L时，接菌处理对紫花地丁地上部分的镉含量无显著差异，说明低浓度镉胁迫下的3种接菌处理对紫花地丁地上部分镉含量有相似的作用。

图中数据为平均值±标准差，n=5；不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

随着Cd处理浓度的增加，BS接菌、PA接菌以及混合接菌的根系镉含量均高于地上部分镉含量，且在10 和100 mg/L Cd浓度处理下，BS接菌和PA接菌根系镉含量增幅最大分别为16.10%、23.09%，2种Cd浓度处理下根系镉含量大小排序为混合接菌>PA接菌>BS接菌。由此得出高浓度Cd处理，混合接菌比单接一种菌更能促进紫花地丁根系对镉的吸收，从而减少土壤中重金属含量。接种促生菌通过改变重金属的价态或形态增强重金属的可溶性，促进植物对重金属的吸收和富集[25]。接种不同的菌种，植物对重金属所产生累积机制不同，地上和根系的镉含量随着Cd处理浓度的增加而增加，可以得出紫花地丁在单接菌及混合接菌后同时增加了植物地下根系对土壤中镉的吸收和积累。接种混合菌后，2种菌协同促进植物对重金属吸收积累。枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌之间的相互作用机制仍有待验证。

2.5 紫花地丁生长生理性状与镉含量的相关性分析

利用Canoco 5 进行主成分分析(PCA)，为了探讨紫花地丁的生长生理指标、根系和地上部分镉含量13个指标之间关系。如图4所示，在PCA排序轴中，第一排序轴解释了86.15%, 主要解释了紫花地丁的营养元素，第二排序轴解释了10.21%，主要解释了地上生物量和地下生物量，前2个排序轴共解释了96.36%，这两轴为主成分轴。全氮(r=0.963，P<0.01)、全钾(r=0.885，P<0.01)和全磷(r=0.786，P<0.01)与第一主成分轴呈极显著正相关，地上生物量(r=0.794，P<0.05)和地下生物量(r=0.686，P<0.05)与第二主成分轴呈显著正相关。

A1，株高；A2，地上生物量；A3，地下生物量；RL，根系长度；RSA，根系表面积；RB，根分叉数；RD，根直径；RT，根尖数；TN，全氮；TP，全磷；TK，全钾，SCd，地上镉含量；RCd，地下镉含量

3 讨 论

镉胁迫处理显著抑制了紫花地丁株高的生长、地上生物量和地下生物量的积累。接种菌后促进了紫花地丁的生长。镉浓度达到100 mg/L表现出敏感性，其生长受到明显的抑制作用，原因是重金属镉易被植物吸收并积累，超过一定程度时会对植物产生毒害作用[26]，加入菌剂后缓解效果不明显。低浓度镉胁迫下紫花地丁在生长过程中表现出一定的耐受性，铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌在植物根表自然成膜分泌EPS产物，有毒微量重金属的存在可以促进EPS的产生[27]，进而能够促进紫花地丁地下部分生长，但随着镉胁迫浓度的升高，重金属镉对细菌生长存在一定的毒性且浓度越高对细菌抑制越强烈，地下生物量逐渐受到抑制。杨璐等[28]研究发现，枯草芽孢杆菌菌剂对冬小麦的生长有一定的促进作用，镉胁迫下，添加铜绿假单胞菌菌液及菌剂处理显著促进了水稻的生长与干物质积累,降低了水稻各部位的镉含量与富集量[29]。

镉胁迫下接种PA菌对根系表面积和根长有显著的促进作用，根系表面积接菌处理显著高于未接菌。铜绿假单胞菌可促进植物在重金属胁迫环境下增加根的生长和根系表面积，从而增加吸收水分与营养物质，进而增强植物抗性，也能增加重金属的有效根表面积，促进重金属的吸收、转运和积累[30]。促生菌接种情况对根尖影响显著，接种菌与根系周围存在并与植物结合，改善了根系在土壤中的分布从而有更多的根系定殖点。100 mg/L的镉处理对根分叉数影响显著，说明高浓度的镉对紫花地丁根系造成了严重的毒害作用，严重影响了植物对重金属的吸收[31]。

根际促生菌提高植物对重金属的抗性，使其生长不受到影响促进植物对氮营养物质的吸收，提高植物的生物量增加植物从土壤中吸收重金属的总量。本试验中，接种处理的地上全氮占比均增长，接种不同菌剂中混合接种全氮占比均增长且增幅最大。不同接种PGPR对植物氮磷占比影响结果有很大差异，接种BS和PA混合菌对植物地上和地下部分全氮占比影响最大，提高了紫花地丁的营养元素的含量[32]。

根际促生菌对不同镉浓度处理的镉含量影响不同。低浓度镉胁迫下，接菌处理对紫花地丁地上部分的镉含量无显著差异，说明低浓度镉胁迫下的3种接菌处理对紫花地丁地上部分镉含量有相似的作用。高浓度镉处理，混合接菌比单接一种菌更能促进紫花地丁根系对镉的吸收。不同的细菌可能会竞争或抑制联合植物修复，枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌之间的相互作用机制仍有待验证。

4 结 论

Cd胁迫抑制了紫花地丁株高的增加、地上生物量和地下生物量的积累，接种菌促进了紫花地丁的生长。镉胁迫下PGPR对紫花地丁交互作用表明，接种铜绿假单胞菌对根系表面积有显著的促进作用，接种混合菌对根长促进效果最好。混合接菌的镉含量比单一接菌后镉含量多，紫花地丁在单接菌及混合接菌后增加了植物地下根系对土壤中镉的吸收和积累。