内生菌与根际细菌对棉花的促生与诱导抗病作用

佐长赓, 王静怡, 牛新湘, 刘 萍, 管力慧, 党文芳, 杨红梅, 楚 敏, 王 宁, 林 青, 王有武, 娄 恺, 史应武,6

(1.新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐 830091;3.新疆特殊环境微生物实验室,乌鲁木齐 830091;4.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所,乌鲁木齐 830091;5.塔里木大学植物科学学院，新疆 阿拉尔 843300;6.农业农村部西北绿洲农业环境重点实验室,乌鲁木齐 830091)

【研究意义】中国是世界上最大的棉花生产国和消费国，年产量约591万t，新疆是我国最大的产棉区，其产量占全国总产量的85%以上[1]。由于新疆棉花的连年轮作，棉花黄萎病也日趋加重，极大影响了棉花的产量和品质，造成了巨大的经济损失[2]。目前，抗病品种研发尚处于初级阶段，生物防治已成为重要的防治方法之一，很多微生物被证明有生防效果[3-5]。植物诱导抗性是生物防治的途径之一，诱导系统抗性(ISR)是指植物根和根际微生物之间的相互作用引发植物防御系统，形成许多新的化学物质，对抗疾病病原体，如细菌、真菌和病毒[7]。【前人研究进展】诱导抗性是植物进行自我保护的重要方法。大量研究表明，内生菌及根际细菌可以定殖在植物根际或体内[8]，抑制植物病原菌，还能发挥诱导抗性提高植物抗病能力[9]，促进植物生长，增加作物产量[10]。周东兴等[11]报道在生防细菌作用下，番茄中酶活显著提高，有效防治番茄枯萎病。杨亚茹等[12]报道内生菌可促进幼苗生长，提高植物抗氧化能力，提高辣椒产量。赵沛等[13]评价了棉花内生真菌对棉花黄萎病的防效效果，菌株CEF-373成功激活了相关防御酶活和病程相关蛋白基因PR10的表达，表明棉花内生真菌CEF-373菌株有较好的生物防治应用前景。【本研究切入点】本课题组前期从棉花中筛选出4株对棉花黄萎病具有防治效果的内生菌和根际细菌[14]，研究发现，4株菌在棉花体内的定殖数量先上升，第50天时趋于稳定。因此，本研究选取第50天棉花为研究对象，通过测定第50天棉花株高、根长、根毛数、叶片数和棉花叶片中相关防御酶活，分析内生菌及根际细菌对棉花的促生作用和诱导抗病作用。【拟解决的关键问题】本文为内生菌及根际细菌提高植物抗逆性，促进植物生长提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株及棉花品种 供试病原菌为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，由新疆农业科学院植物保护研究所刘海洋副研究员馈赠[15]。供试内生菌及根际细菌BacillusvelezensisBHZ-29、B.atrophaeusSHZ-24菌株筛选自博乐、石河子棉株体内；B.subtilisSHT-15、B.vanilleaSMT-24 分离自石河子棉株根际土壤[16]。棉花品种新陆早36号，种子由中国农业科学院石河子棉花研究所尤崇志副研究员馈赠。

1.1.2 土壤样品的采集和处理 于乌鲁木齐安宁渠、博乐、石河子、库尔勒、图木舒克实验地采集棉株根际10～15 cm土壤，土样在室内经自然晾干后，用直径2 mm的筛网过筛、混匀，装入密封袋中保存在 4 ℃冰箱中备用[17]。

1.1.3 培养基 NA培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉粉 3.0 g，氯化钠 5.0 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.3。NB培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，氯化钠 5.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2。PDA培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH自然。Czapek’s培养基：NaNO33.00 g，K2HPO31.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，KCl 0.50 g，FeSO4·4H2O 0.01 g，蔗糖 30.00 g，蒸馏水 1000 mL，pH 6.5。

1.2 试验方法

1.2.1 内生菌及根际细菌种子液及大丽轮枝菌发酵液制备 挑取内生菌及根际细菌单菌落接种于50 mL NB液体培养基中，32 ℃、180 r/min振荡培养2 d后作为种子液，将种子液以3 %的量接入到200 mL NB液体培养基中，32 ℃、180 r/min 振荡培养2 d即得到内生菌及根际细菌发酵液。用直接6 mm打孔器取大丽轮枝菌菌饼倒贴于PDA平板上，25 ℃恒温培养15 d，再用打孔器取直径6 mm的菌饼，接种于200 mL察比克培养基中，每瓶10个菌饼，25 ℃、150 r/min振荡培养7 d即为大丽轮枝菌发酵液[18]。

1.2.2 内生菌及根际细菌对棉花的促生作用 分别将灭菌土和非灭菌土装至长8 cm、宽6 cm的营养钵中，每钵种植8粒颗粒饱满的棉种，覆土后抚平表层土壤，放入智能培养箱出苗，昼/夜光照与温度分别为：13 h/11 h，26 ℃/24 ℃，光照强度：60 klx，相对湿度：60%。内生菌及根际细菌发酵液分3次灌溉。播种后18 d左右棉苗一片真叶初现时将SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液均以10 mL/钵(108CFU/mL)均匀浇灌棉苗，对照接种等体积灭菌NB培养基，继续放置智能培养箱培养。7 d后接种大丽轮枝菌，大丽轮枝菌的接种方法：将营养钵中棉花须根在花盘中磨损后浸泡在大丽轮枝菌发酵液中，接种量以10 mL/钵(107CFU/mL)计算。接种大丽轮枝菌5 d后，第二次接种内生菌及根际微生物发酵液10 mL/钵(108CFU/mL)。10 d后第3次接种内生菌及根际微生物发酵液10 mL/钵(108CFU/mL)。棉苗50 d时，将棉苗拔出后冲洗干净，统计所有棉株的株高、根毛数、叶片数、根长。

1.2.3 防御酶活性、丙二醛和木质素含量的测定 分别称取0.1 g叶片组织用于提取粗酶，酶活均按照酶活性试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)步骤操作，利用紫外—可见光分光光度计检测防御酶活性(POD、PPO、CAT、SOD、PAL酶活，丙二醛和木质素含量)变化[19]。

2 结果与分析

2.1 内生菌及根际细菌对棉花的促生作用

经过SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理的灭菌土壤与非灭菌土壤的棉株株高、叶片数、根长、根毛数与对照组相比，均有不同程度的提高，同时，灭菌土中经4种菌株发酵液处理后的株高显著高于对照(图1)。灭菌土与非灭菌土相比，同一处理非灭菌土中的根长、根毛数、叶片数均高于灭菌土，SHZ-24和BHZ-29处理后灭菌土株高高于非灭菌土，而SMT-24与SHT-15处理后非灭菌土株高高于灭菌土。

图中数据为平均数±标准差，柱上不同小写字母表示经Duncan’s新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。SS-灭菌土壤；NS-非灭菌土壤，下同

2.2 内生及根际细菌对棉花防御酶活性的影响

2.2.1 内生菌及根际细菌对过氧化氢酶(CAT)的影响 在灭菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理后CAT酶活均高于对照组，分别是对照处理的1.99、1.52、1.93和1.52倍。SHZ-24处理的CAT酶活性最高，达到83.23 μmol/(min·g)。非灭菌土壤中，SMT-24处理CAT酶活是对照处理的1.74倍，SHT-15处理CAT酶活性与对照组相当，SHZ-24、BHZ-29 菌株发酵液处理CAT酶活低于对照组，分别是对照处理的89.19%和28.09%(图2-A)。

2.2.2 内生菌及根际细菌对多酚氧化酶(PPO)的影响 在灭菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15菌株发酵液处理后PPO酶活均显著高于CK对照组，分别是对照处理的2.84、1.45和2.82倍，BHZ-29菌株发酵液处理后PPO酶活是对照处理的1.08倍，SMT-24处理的PPO酶活性最高，达到108.94 U/g FW；非灭菌土壤中，SHZ-15处理后CAT酶活比对照组低，是对照处理的94.51%，其他3种菌发酵液处理均高于CK对照组，分别是对照处理的1.13、1.04、1.11倍(图2-B)。

2.2.3 内生菌及根际细菌对超氧化物歧化酶(SOD)的影响 在灭菌土壤和非灭菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理后SOD酶活均高于CK对照组，灭菌土中分别是对照处理的1.37、1.43、1.27和4.25倍，BHZ-29处理的SOD酶活性最高，达到430.59 U/g FW(图2-C)；非灭菌土中处理组SOD酶活分别是对照处理的3.19、6.47、4.81、1.75倍，SMT-24处理的SOD酶活性最高，达到456.93 U/g FW。

2.2.4 内生菌及根际细菌对过氧化物酶(POD)的影响 在灭菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理后POD酶活显著高于CK对照组，分别是对照处理的4.96、5.34、6.67和5.18倍，SHT-15处理的POD酶活性最高，达到2849.87 U/g FW；非灭菌土壤中，SHZ-24、SHT-15、BHZ-29处理后POD酶活显著高于对照组，分别是对照处理的8.18、10.57和6.92倍，SMT-24菌株发酵液处理后POD酶活是对照处理的2.95倍(图2-D)。

2.2.5 内生菌及根际细菌对苯丙氨酸解氨酶(PAL)的影响 在灭菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理后PAL酶活显著高于CK对照组，分别是对照处理的2.36、2.05、1.60、2.12倍，SHZ-24处理的PAL酶活性最高，达到59.17 U/g FW，非灭菌土壤中，SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理后PAL酶活均高于CK对照组，分别是对照处理的1.04、1.45和2.03倍，SHZ-24处理PAL酶活显著低于CK对照组，是对照处理的84.92%，SHZ-24处理PAL酶活性最低，为23.40 U/g FW(图2-E)。

图2 内生菌与根际微生物接种后对棉花叶片CAT、PPO、SOD、POD、PAL活性的影响

2.3 内生菌及根际细菌对棉苗叶片丙二醛和木质素含量的影响

2.3.1 内生菌及根际微生物对丙二醛(MDA)含量的影响 在灭菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理后MDA含量低于CK对照组，分别是对照处理的75.78%、82.62%、94.13%和79.38%，SHZ-24处理MDA含量最低，为26.34 nmol/g FW；非灭菌土壤中，SMT-24、SHT-15、BHZ-29处理后MDA含量低于对照组，分别是对照处理的45.46%、71.94%、74.25%，SHZ-24处理后丙二醛含量高于对照组，是对照处理的1.19倍(图3-A)。

2.3.2 内生菌及根际细菌对木质素含量的影响 在灭菌土壤中，SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理后，木质素含量显著高于对照处理，分别是对照处理的1.04、1.18、1.05、1.07倍；非灭菌土壤中，除SHT-15菌液处理后木质素含量低于对照组，是对照处理的95.78%，其他处理均高于对照处理，分别是对照处理的1.15、1.62、1.05倍，SMT-24处理木质素含量最高，达到4.11 mg/g DW(图3-B)。

图3 内生菌与根际微生物接种后对棉花叶片丙二醛、木质素含量的影响

3 讨 论

本研究结果表明，接种后50 d，内生菌及根际细菌发酵液处理能促进不同土壤中棉花生长，在灭菌土中，SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株发酵液处理后显著增加了棉花的株高，同时，经过内生菌及根际细菌处理后，不同程度提高棉花防御相关酶活，减少MDA的积累，从而增强棉花植株对病害的抗性。

棉花植株本身就有一套完整的防御体系，生物或非生物的胁迫都可以刺激这种防御反应，因此，通常将防御酶活性变化作为衡量植株防御能力的重要指标[20]。CAT广泛存在植物细胞中，维持细胞H2O2正常水平[21]，POD可减少活性氧积累，维护膜结构完整性[22]，SOD可清除自由基，延缓植物衰老，PAL可促进植物产生酚类化合物，从而达到抵御病害侵染的效果，增强植物抗病性。植物在逆境条件下通常利用产物MDA作为指标来表示植物对逆境条件反应的强弱，木质素在植物防御体系中可增加细胞壁韧性，提高植物抗病原菌侵入能力[23]。本研究中，在50 d时不同土壤中棉株防御相关酶活性和木质素含量均增加，MDA含量下降，表明4株菌能诱导棉株体内防御酶活性表达，增强棉花自身免疫。相较灭菌土和非灭菌土而言，棉株生物量变化在灭菌土壤中较非灭菌土壤变化趋势平缓的原因经推测可能是非灭菌土壤中环境较复杂，对所施内生菌和根际细菌的影响不稳定，使发挥其活性存在很多不确定性。本研究中丙二醛含量最低值和木质素含量最高值均出现在非灭菌土壤中，可能是非灭菌土壤的微环境更适合根际细菌的生存[24-25]。

综上所述，内生菌及根际细菌有较好的应用前景，在50 d时还能有效的促进棉花植株的生长，同时能诱导棉花植株防御酶活性的表达，提高棉花防御相关酶活，增强棉花植株的系统抗病性，有效预防棉花黄萎病的发生。内生菌及根际细菌是绿色、安全的生物防治方法，加大内生菌及根际细菌大田应用研究有助于生物防治在绿色食品种植中的推广应用，进而保障农产品质量安全及农业可持续发展。

4 结 论

接种后50 d，SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29均可促进棉株生长，增加棉株株高、根长、叶片数、根毛数，同时也能提高棉花防御酶CAT、SOD、PAL、POD、PPO活性，增加棉株体内木质素含量，降低棉株丙二醛含量，减少对棉株的毒害作用，增强棉株抗病性。