接种五种根系真菌对油松幼苗促生效应的研究

徐玲洁，郑妍妍，冯花蕾，周 勇

(河北农业大学，河北 保定 071000)

【研究意义】油松(Pinustabulaeformis)对菌根真菌的依赖性很强，人工接种菌根真菌可促进油松生长，提高油松抗逆性[1]。此外，油松也能与多种真菌形成共生体，如杨韧等[2]在陕北不同地区油松根系真菌资源调查中分离鉴定出21种真菌，包括外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi, ECMF)、DSE、腐生真菌和病原真菌等。虽然油松菌根资源丰富，但大部分仍未应用于生产实际，具有优良促生效果的菌剂较少[3]。因此，发掘高效促生的真菌资源并探明其促生机制对油松林木种植和生态建设具有重要理论和现实意义。【前人研究进展】油松在我国干旱半干旱地区广泛种植，是我国北方地区重要的园林绿化树种[4]。此外，油松还能够提供多种重要的生态系统功能，包括富集水源、提高土壤肥力和防风固沙等[5]，在生态修复和林业发展中占有重要地位[6]。然而，由于油松幼苗生长缓慢，育苗期较长，因此，如何促进油松幼苗生长从而加速成苗是当前人工植被建设亟待解决的问题。目前，通过菌根真菌(Mycorrhizal fungi)和内生真菌(Endophytic fungi)在内的植物根系真菌提高宿主生长及抗逆性已被广泛报道[7]。菌根真菌是存在于植物根部的一类重要真菌类群，大量研究表明，菌根真菌能够为宿主植物带来多种有益影响，如促进植物生长和养分吸收，以及增强宿主对生物干扰和非生物胁迫的抵抗能力等，其在生态系统建立和物质循环过程中扮演着重要角色[8]。除菌根真菌外，植物根系中也能同时定殖其他类型真菌，如深色有隔内生真菌(Dark sepatete endophyte, DSE)、印度梨形孢(Piriformosporaindica)、木霉(Trichoderma)、白僵菌(Beauveriabassiana)、绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)、麝香霉(Muscodor)等[9]，具有物种丰富，生态位广等特点。其中，DSE是植物根系内生真菌的一大类群，其特征是定殖于植物根细胞内部或细胞间隙，并形成深色有隔菌丝和微菌核[10]。DSE宿主专一性不强，存在于各种菌根和非菌根植物根系中，且分布极为广泛，尤其是在干旱、高山、极地、重金属污染等逆境生态系统中，这使得DSE受到越来越多研究者的关注[11-12]。研究表明，DSE不仅能体外纯培养，同时还能提高宿主生态适应性，促进植物生长[13-14]，如Tellenbach等[15]研究表明，云杉(Piceaasperata)苗接种DSE菌种(Phialocephalasubalpina)可以降低腐霉菌对其的危害，并且提高了云杉苗的生物量。因此，利用DSE培育菌根化苗木在生态系统植被建设中具有广阔应用前景。【本研究切入点】自然生境的植物通常共生更为丰富的真菌资源，具有巨大的开发潜力。本文选取油松作为研究对象，从自然生境油松分离不同类型根系真菌，并人工接种至油松幼苗，测定植株地上部分、根系和根围土壤相关指标，分析植物根系共生真菌对油松生长和生理特性以及根围土壤养分的影响。【拟解决的关键问题】发掘优良的油松根系真菌资源，阐明根系真菌对油松的生理生态效应，为研发油松高效菌剂和构建优良菌树组合体系提供依据和材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种：5株根系真菌分离自河北雾灵山自然保护区(117°17′～117°35′E，40°29′～40°38′N)油松根系。将采集的油松根系清洗后剪成1～2 cm根段，在体式显微镜下找出带有根系真菌结构的根尖，经75%乙醇和3%次氯酸钠表面灭菌，无菌水冲洗后置于PDA培养基内，25 ℃恒温倒置培养。待培养基内长出菌丝后进行纯化，经过纯化后的菌株一部分进行插片培养，待菌丝生长至盖玻片中部，用于真菌微观形态学观察。另一部分纯化菌株用于真菌物种鉴定。将鉴定后的真菌保存于河北农业大学园林植物生态实验室。所有菌株在PDA培养基上28 ℃条件下培养用于接种试验。

种子处理及幼苗培育：挑选大小均匀颗粒饱满的油松种子，于河北农业大学园林与旅游学院温室育苗。试验前，使用0.5%的KMnO4溶液振荡消毒1 h，温水浸种1 d后置于铺有灭菌纱布的培养皿中，25 ℃催芽。培养基质由沙子与土壤(体积比1∶1)组成，经高温高压蒸汽灭菌(121 ℃，2 h)后备用，当胚根伸出0.1 cm时移栽到花盆中，每盆3粒，覆1 cm厚的基质，浇透水后，室温培养，期间定期浇水，避免幼苗缺水。

1.2 试验设计

本试验设置油松接种牛肝菌属(Su)、福廷瓶头霉(Pf)、须壳孢属(Ps)、短梗蠕孢菌(Po)和斯氏曲霉(As)和不接种对照(CK)，共6个处理，重复5次。无菌条件下，在PDA培养基中长势良好的真菌菌落边缘处，取直径为6 mm的菌饼接种于灭菌基质上，每盆接种2个菌饼，保证每盆的接种量相等，幼苗栽植时使其根系尽量与菌饼充分接触，对照处理接种2个直径相等的且未生长真菌的培养基，同样方法进行幼苗栽植。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长指标测定 真菌接种1个月后检测油松根系真菌定殖率，接种处理植株真菌定殖率均超过30%(CK处理植株真菌定殖率为0%)。植物生长10个月时收获，收获时测量苗高和地径。然后将幼苗地下部分用自来水冲洗，用吸水纸吸干表面水，一部分用于根系形态测定，另一部分用于苗木的生物量及营养元素含量测定。

1.3.2 菌根生长响应 菌根生长响应(MGR)计算公式为：MGR(%)=100×(M-NMmean)/NMmean，式中,M表示接种处理的植物总干重，NMmean表示未接种处理的植物平均总干重。MGR>0表示接种处理促进植物生长，MGR<0表示接种处理抑制植物生长[16]。

1.3.3 根系形态指标测定 从各处理中选取长势一致的油松幼苗，用蒸馏水清洗根系附着的杂物后，将幼苗根系与地上部分分离并放置于树脂玻璃托盘中，使用中晶扫描仪(MRS-9600TFU2L,全友电脑科技(吴江)有限公司)扫描根系样品并获取根系图像，用WinRHIZO图形分析系统对根系长度、表面积、体积、平均直径等指标进行分析。

1.3.4 植物营养元素含量测定 油松地上及地下植株经105 ℃杀青20 min，80 ℃烘干至恒重，研钵磨碎过60目筛。称取0.5 g样品于消煮管中，加入15 mL混酸[v(硫酸)∶v(高氯酸)=10∶1]消煮至无色透明，将消煮液定容至100 mL，用于氮、磷和钾的测定。采用凯氏定氮法测定全氮含量(N)，钼锑抗比色法测定全磷含量(P)，火焰分光光度法测定全钾含量(K)[17]。

1.3.5 土壤营养元素含量测定 用毛笔轻刷苗木根部，使得根周围2 mm以内的土散落下来，该散落的土壤即为根围土，取根围土壤进行风干处理，之后过60目筛，土壤速效磷经碳酸氢钠提取后采用钼锑抗比色法测定，土壤速效钾经醋酸提取后采用原子分光光度计进行测定。土壤铵态氮采用KCl浸提—靛酚蓝比色法测定，土壤硝态氮采用酚二磺酸比色法测定[17]。

1.4 数据处理

数据利用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan多重比较(P< 0.05)对各指标在不同处理间的差异显著性进行检验。

2 结果与分析

2.1 共生真菌的分子鉴定

从油松根系分离出的5株共生真菌，分别标记为WL1、WL2、WL3、WL4和WL5，利用共生真菌ITS序列与GenBank数据库中同源序列进行比对，构建系统发育树，并通过形态特征鉴定5株真菌为一种外生菌根真菌牛肝菌属Suillussp.(Su)、4种内生真菌福廷瓶头霉Phialocephalafortinii(Pf)、须壳孢属Pseudopyrenochaetasp.(Ps)、短梗蠕孢菌Pleotrichocladiumopacum(Po)和斯氏曲霉Aspergillusspelunceus(As)(图1～2)。

A、F:牛肝菌属；B、G:福廷瓶头霉；C、H:须壳孢属.；D、I:短梗蠕孢菌；E、J:斯氏曲霉；标尺= 50 μm

2.2 接种处理对油松幼苗生长的影响

方差分析结果表明，接种处理显著影响了油松幼苗株高、地径、地上和地下生物量，但不同种类真菌对宿主的影响存在差异(图3)。接种Ps和Pf显著提高了幼苗的苗高，较CK分别增加了10.96%和3.99%。而接种Po和As对幼苗苗高的影响表现为负效应。对于苗木地径，接种真菌对幼苗生长表现为有益或无影响，其中接种Su和Ps的苗木地径较CK显著增加了30.00%和15.00%，且Su显著高于Ps。

图2 基于18S rDNA ITS序列构建的系统发育树

CK:不接菌处理；Po:短梗蠕孢菌; Pf:福廷瓶头霉;Ps:须壳孢属; As:斯氏曲霉;Su:牛肝菌属; 不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)，下同

多数真菌对油松的生物量积累表现为正效应，且对油松根系的促生作用更为明显。接种Su显著提高苗木地上和地下部分生物量，分别较CK提高了31.57%和47.37%，而其他真菌则表现为无影响或负效应(As)。除As外，接种真菌均有增加宿主地下生物量的趋势，且接种Pf显著提高了苗木地下生物量，较CK提高了36.84%。可能是因为根系真菌通过侵染植物根系改变根形态，增加根系吸收面积，促进植物根系吸收水分和养分，提高植物矿质元素含量，从而促进苗木的生长。

2.3 油松幼苗菌根生长响应

油松幼苗的菌根生长响应受到真菌种类的显著影响(图4)。接种Pf、Ps和Su处理时油松幼苗的生长响应为正值，同时接种Su时生长响应值最高且显著高于接种Po和As处理，表明Pf、Ps和Su3种菌株对油松幼苗具有促进作用，且接种Su促进油松幼苗生长效果较好。但是，接种Po和As的条件下，油松幼苗生长响应为负值，说明这2种真菌对宿主油松幼苗生长产生了抑制效应。由此可见，油松幼苗与其根系的真菌具有明显的相互选择性。实际上，同一种根系真菌与植物宿主的关系，在特定环境下可以从共生转化为寄生关系，也可以从寄生转化为共生关系[18]，换言之在不同环境条件下ECMF、DSE或其他类型真菌的侵染可能促进植物生长发育，协助植物增加对各种胁迫的耐受性，也可能对宿主植物造成不利影响。

图4 油松幼苗菌根生长响应

2.4 接种处理对油松幼苗根系形态结构的影响

接种Pf和Ps的幼苗总根长和根表面积显著高于CK处理；对于幼苗的根总体积，接种Su的幼苗根体积显著高于其他接种处理，而接种Po的幼苗根体积显著低于CK植株；与CK相比，接菌处理对幼苗根系的平均直径无显著影响，不同菌种之间只有接种Su时显著高于接种Pf处理(表1)。相似的结果在其它真菌中也有报道，研究发现接种红汁乳菇(Lactariushatsudake)和褐环乳牛肝菌(Suillusluteus)增加了油松根系总长度、表面积和体积，尤其是接种(S.luteus)有利于根系扩大沿根围向不同方向生长的范围，更利于养分和水分的吸收[19]。

表1 不同接种处理对幼苗根系形态结构的影响

2.5 接种处理对油松幼苗营养元素含量影响

对油松植株N、P、K含量分析发现：接种不同根系真菌显著影响了油松幼苗各部分器官的养分含量(图5)。与CK相比，接种Pf和Su均显著促进了苗木地上及地下部分N、P、K含量，Ps显著增加了苗木地上及地下部分P含量，As显著促进了苗木地上部分K含量；在不同菌株之间，接种Pf和Su处理的植物各部分器官的养分含量均高于其他处理，可能是由于接种与油松幼苗亲和力高、促生效果好的ECMF和DSE菌株后，改变了植物根系形态，使得根系更容易吸收土壤中的养分，提高了宿主植物中矿质营养的含量。不同接菌处理间苗木地上部分N、P含量和和地下部分P含量均为：Su>Pf>Ps>CK>Po>As，不同接菌处理间苗木地下部分N、K含量均：Su>Pf>Po>CK>Ps>As，表明Su可能对油松幼苗的养分吸收最有益。

图5 不同接种处理对油松幼苗N、P、K含量的影响

2.6 接种处理对油松土壤营养元素含量的影响

在不同处理中，接种真菌对油松幼苗的根围土壤养分含量影响显著。与CK相比，接种Pf和Su处理显著提高了土壤硝态N、铵态N、速效P和速效K的含量；而接种Po和Ps处理与CK无显著差异。不同菌株之间对土壤养分含量的影响表现出一定差异，其中接种Su油松的土壤硝态N含量显著高于其他接菌处理，接种Pf和Su处理的土壤铵态N、土壤速效P和速效K含量显著高于Po和As处理(表2)。

表2 不同接种处理对油松根围土壤养分的影响

3 讨 论

本研究中探究了5种植物根系真菌对油松幼苗生长和根系形态特征的影响，结果表明多数根系真菌对油松幼苗的生长有促生效应，但受到真菌种类影响。其中，接种外生菌根真菌(ECMF)菌种Su对油松的生长有显著促进作用，表现为接种Su处理显著提高了油松幼苗的地径、生物量和根体积等指标。该结果与前人关于植物与ECMF共生关系的研究结果一致，如张茹琴等[20]研究发现接种ECMF灰鹅膏菌(Amanitavaginata)和血红铆钉菇(Gomphidiusviscidus)显著提高了油松株高，该结果不仅适用于油松菌根化育苗，而且也有助于自然生态系统中林木的生长。此外，已有研究发现，深色有隔内生真菌(DSE)可能具有与菌根真菌相似的生态学功能[21]，如接种DSE可以提高植物幼苗的生物量、促进植物对营养物质的吸收、增强植物的抗逆性、抗病性等[22-25]。本研究也发现，接种DSE菌种Ps和Pf显著提高了油松幼苗总根长和根表面积，且接种Pf显著提高了植株地下部分生物量。由于根系形态构型中根系长度和表面积等是衡量植物根系分布范围和养分吸收能力的重要指标，因此，与ECMF接种效应相似，本研究也表明接种DSE可以调整油松的根系结构，增加根系吸收面积，从而促进油松的生长，但该影响与DSE真菌种类有关。

研究表明，植物根系真菌对于林木幼苗的促生效果以及林木菌根生长响应因菌种或菌株而异[26]。本研究接种的5个植物根系真菌中，Pf、Ps和Su均能与油松幼苗形成良好的共生关系，而Po和As与油松幼苗的共生能力较弱，其菌根生长响应为负值，这可能是由于真菌给宿主带来的有益影响不足以抵消其对宿主植物的营养消耗造成的。Chu等[27]研究也发现，ECMF和DSE对油松抗松树萎蔫病的影响依赖于真菌种类，接种不同真菌后对油松的影响包括了正效应、中性和负效应。邹慧等[28]研究结果表明，接种的6个ECMF菌种中，只有接种Sclerodermapolyrhizum与Sclerodermaflavidum能够显著提高宿主西南桦(Betulaalnoides)幼苗生长量、养分含量、光合效率，说明两者对于西南桦幼苗的亲和力及促生效果明显优于其它菌种。因此，对于同一个树种，菌种类型与幼苗菌根的促生效果密切相关，而在菌根应用技术中筛选合适的菌—树组合至关重要。

N、P、K作为植物体所需的重要大量元素，对植物的生长和发育起着重要作用。本研究发现，根系真菌的存在明显促进了植物对N、P、K的吸收和利用，表现在Pf、Ps和Su对油松幼苗地上和地下部N、P、K的含量均有不同程度的增加，特别是接种Pf和Su均显著促进了苗木地上及地下部分N、P、K含量。与本研究结果相似，汪远秀等[29]研究发现，接种S.luteus的马尾松幼苗株高、根系形态和生物量及根茎叶中N、P、K含量均高于未接种苗。产生这种结果的原因可能是菌根真菌可以释放以硝酸盐、铵、游离氨基酸、核酸等形式被固定在腐殖质中的N，以及分解难溶性的磷灰石、磷铝石等磷矿物，将其转化为可被植物吸收利用的有效P，充分调动土壤中的养分，吸收转运给宿主植物，供植物生长[30]。本研究中，油松与分离培养的真菌Pf和Su均能够形成良好的互惠共生关系，改变油松生长特性，从而对植物养分的吸收产生一定的影响。此外，接种ECMF和DSE后不仅能够对油松自身生长及养分吸收产生影响，还能够改善油松幼苗根围土壤微环境，表现为接种Pf和Su的幼苗根围土壤养分中N、P、K含量较对照有显著增长。接种ECMF和DSE菌株在提高根围土壤养分含量方面有优良的表现，原因可能是2种植物根系真菌可以通过自身或利用周围微生物及植物等分泌多种酶类和次生代谢产物来分解有机质，改善土壤结构与环境，加速物质循环和增强宿主植物对有机营养的利用，从而加速生态系统中的物质循环[31-32]。

4 结 论

接种Pf和Su显著提高了油松幼苗地上和地下部分生物量、植株养分以及土壤养分含量，对油松具有促生效应，且对共生体所在生境产生一定影响。因此，这2种植物根系真菌在油松育种栽培中具有较好的应用潜力。考虑到自然生境中真菌的应用可能受到多种环境因素的影响，在今后的研究中将继续探讨不同环境条件下植物根系真菌的作用潜力及影响机制，为其作为生物制剂用于林业发展提供理论支持。