自锚定β-内酰胺酶荧光探针

谢贺新，李仔义，宋 恒

(华东理工大学 药学院，生物反应器工程国家重点实验室，上海市新药设计重点实验室，上海 200237)

β-内酰胺类抗生素由于具有毒性低、疗效显著等一些优点，长期以来是临床中应用最为广泛的一类抗生素[1]. 然而，由于大量使用，部分病菌逐渐适应了这些药物的存在，产生了严重的耐药性. 更为严重的是，这些耐药病菌通过各种途径在全球范围内快速传播出去. 这些耐药菌的出现与传播严重地削弱了现有抗生素的有效性，对人类的健康造成了极大的威胁[2].

病菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的一个主要原因是在病菌中产生了一类能够快速水解、破坏β-内酰胺环从而使抗生素失效的蛋白酶，即β-内酰胺酶(β-lactamase)[3].由于β-内酰胺酶具有非常高的催化活性，因此，基于β-内酰胺酶活性的耐药菌快速检测方法陆续被发展出来. 这其中，β-内酰胺酶荧光探针由于操作简单、检测灵敏度高等优点，受到了较多的关注.

早在1998年，诺贝尔化学家奖获得者钱永健教授报道了首个用于细胞内快速检测β-内酰胺酶活性的荧光探针[4]. 在此基础上，一系列基于相似原理的β-内酰胺酶荧光探针被陆续发展出来[5-8]. 但是，目前报道的大部分荧光探针在被β-内酰胺酶水解激活后通常会从相关耐药菌中快速扩散出去，难以通过对耐药病菌的共价键标记从而实现对病菌个体的快速检测.

本研究前期工作基于高度活性的醌亚甲基化学(QM)发展了一个可用于耐药病菌标记的增强型荧光探针CFC-2[9]. 但是后续研究发现，CFC-2在被β-内酰胺酶水解激活并标记后产生的荧光基团量子效率较低，荧光强度相对较弱，在进一步应用中存在着一定的问题. 因此对探针分子进行了重新设计，通过对荧光标记基团的进一步优化，发展了具有更高荧光增强效率和标记效率的荧光探针.图1是探针CFC-2、CFC-3、CFC-4和CDC-1的化学结构及共价键标记机理.

图1 探针CFC-2、CFC-3、CFC-4和CDC-1的化学结构及共价键标记机理Fig.1 The structure of fluorogenic probes and proposed mechanism for labeling of protein

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-头孢烷酸二苯甲基酯(GCLH)、戴斯-马丁氧化剂、间氯过氧苯甲酸、Na2S2O3、NaCl等试剂均为分析纯.荧光色谱仪(日本Horiba Scientific Fluoromax-4)，紫外-可见光谱仪(日本Shimadzu UV-1800), 多功能酶标仪(美国Molecular Devices SpectraMaxi3)。

1.2 探针分子的合成

化合物4的合成[9]：如图2所示，将GCLH(284.3 mg，0.53 mmol)、K2CO3(221.1 mg，1.60 mmol)、化合物1(103.0 mg，0.54 mmol)、碘化钾(869.3 mg，5.2 mmol)混合于3 mL丙酮中室温搅拌2.5 h. 通过薄层色谱(TLC)监测发现原料反应完全后，向体系中加入水(30 mL)和二氯甲烷(60 mL).分液后水层用二氯甲烷萃取两次，有机相分别用Na2S2O3、NaCl水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，经初步柱层析得到化合物2和其异构体2′的混合物(146.9 mg). 将这些混合物与戴斯-马丁氧化剂(DMP，136.6 mg，0.32 mmol)溶于4 mL 二氯甲烷中. 室温搅拌1.5 h，TLC监测反应完全后将反应液用二氯甲烷(30 mL)稀释并依此用Na2S2O3、NaHCO3、NaCl水溶液洗涤. 有机相用无水硫酸镁干燥并初步经柱层析分离得到化合物3及其异构体3′ (110.2 mg). 将3+3′溶于2 mL 二氯甲烷中，0 ℃下将间氯过氧苯甲酸(mCPBA，85%, 29.6 mg, 0.17 mmol)分批加入溶液中并搅拌0.5 h, TLC监测原料反应完全. 反应液中加入30 mL二氯甲烷稀释并依此用Na2S2O3、NaHCO3、NaCl水溶液洗涤. 有机相用无水硫酸镁干燥并经柱层析纯化得到83.6 mg化合物4，3步总产率20%.1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 10.21(s, 1H), 8.35(s, 1H), 7.53(d,J= 8.7 Hz, 1H), 7.48-7.43(m, 2H), 7.41-7.27(m, 13H), 6.95(s, 1H), 6.78(dd,J= 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.70(t,J= 5.6 Hz, 2H), 6.15(dd,J=10.0, 4.8 Hz, 1H), 5.33-5.27(m, 1H), 4.82(d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.50(d,J= 3.6 Hz, 1H), 3.99(d,J= 18.9 Hz, 1H), 3.71-3.59(m, 2H), 3.29(d,J= 19.0 Hz, 1H).

CFC-4的合成[9]：如图2所示，在氮气氛围中将化合物4(28.4 mg，0.04 mmol)和碘化钠(49.0 mg，0.33 mmol)加入无水丙酮(1.3 mL)中，0 ℃条件下缓慢滴加三氟醋酸酐(33 μL，0.24 mmol). 滴加完成后在同一温度下继续反应0.5 h. 通过TLC监测发现原料反应完全后依次向体系中加入DCM(30 mL)和NaHCO3饱和水溶液( 20 mL)，分液后有机相依次用Na2S2O3、NaCl洗涤,Na2SO4干燥，经柱层析纯化得到19.9 mg化合物5. 将所得化合物5溶于1 mL 二氯甲烷中，0 ℃下滴加二乙胺基三氟化硫(DAST，24 μL，0.18 mmol). 滴毕，同一温度下继续反应1 h后加入 20 mL的饱和NaHCO3溶液，用二氯甲烷(20 mL × 3)萃取，饱和NaCl洗涤，Na2SO4干燥后经柱层析纯化得到11.0 mg化合物6. 在0 ℃下，将化合物6(11.0 mg，0.016 mmol)溶解于DCM:TFA:TIPS = 20∶1∶1(2.2 mL)的混合体系中，0 ℃下反应30 min，HPLC监测原料反应完全，利用C18柱在反相制备HPLC中制备纯化得到3.0 mg的CFC-4，3步总产率为18%.1H NMR(400 MHz, d6-DMSO) δ 9.13(d,J= 8.3 Hz, 1H), 8.41(s, 1H), 7.81(d,J= 8.7 Hz, 1H), 7.35-7.21(m, 4H), 7.16(s, 1H), 7.08(dd,J= 8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.04(s, 1H), 6.90(s, 1H), 6.76(s, 1H), 5.72-5.64(m, 1H), 5.11(d,J= 4.8 Hz, 1H), 5.05(d,J= 12.0 Hz, 1H), 4.94(d,J= 11.9 Hz, 1H), 3.58(dt,J= 46.1, 15.9 Hz, 5H).

CFC-3的合成路线与CFC-4基本相同，但无需进行戴斯-马丁氧化反应.

a) 1, K2CO3, KI, acetone, rt; b) DMP, DCM, rt; c) mCPBA, DCM, 0 ℃, 20% for three steps；d) TFAA, NaI, acetone, 0 ℃; e) DAST，DCM, rt; f) TFA, TIPS, DCM, 0 ℃, 18% for three steps. DMP: Dess-Martin periodinane; mCPBA: m-chloroperbenzoic acid; TFAA: trifluoroacetic anhydride; DAST: diethylaminosulfur trifluoride; TFA: trifluoroacetic acid; TIPS: triisopropylsilane.图2 探针CFC-4的合成Fig.2 Preparation of probe CFC-4

1.3 探针对β-内酰胺酶的光学响应测定

吸收光谱的测定：向CFC-4的PBS(pH 7.4)溶液(10 μmol/L)中加入TEM-1β-内酰胺酶(2 nmol/L)，室温下孵育20 min后用UV-Vis分光光度计测定吸收全谱.

荧光光谱的测定：向CFC-4的PBS(pH 7.4)溶液(10 μmol/L)中加入TEM-1β-内酰胺酶(100 nmol/L)，室温下孵育20 min后用荧光分光光度计测定荧光全谱(激发波长：416 nm).

荧光强度随时间变化测定：向CFC-4的PBS(pH 7.4)溶液(10 μmol/L)中加入TEM-1β-内酰胺酶(1.5 nmol/L)后，立刻用酶标仪测定其在室温中1 h内的荧光强度变化(激发/发射波长：380 nm/460 nm).

1.4 探针对TEM-1 bla的标记实验

将CFC-2、CFC-3、CFC-4及CDC-1[8](100 μmol/L)在PBS(pH 7.4)中分别与TEM-1β-内酰胺酶(6.9 μmol/L)37 ℃下孵育2 h，同时以牛血清蛋白(BSA)做对照分别与相应探针在相同条件下孵育，所有样品进行凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后利用凝胶成像仪进行荧光强度分析(激发波长：365 nm)，随后样品用考马斯亮蓝进行染色.

1.5 探针对细菌的标记实验

37 ℃下将大肠杆菌(E.coli)、TEM-1-transformedE.coli在LB培养基中培养8 h. 离心除去培养基后再用PBS进行洗涤、离心. 菌饼重新悬浮于PBS中，通过测量菌液的OD600来确定菌液浓度. 分别将探针CDC-1和CFC-4(0.2 mmol/L)与E.coli、TEM-1-transformedE.coli(3×108cfu/mL)在37 ℃下孵育1.5 h后利用凝胶成像仪进行荧光强度分析. 样品离心除去上清液，再加入PBS洗涤、离心，菌饼重新悬浮于PBS中，再次利用凝胶成像仪进行荧光强度分析(激发波长：365 nm).

2 结果与讨论

2.1 探针酶响应分析

为了考察探针对于β-内酰胺酶的响应情况，选取了在革兰氏阴性菌中最为常见的TEM-1β-内酰胺酶(TEM-1 bla)作为模型来进行研究.

将探针CFC-4与TEM-1 bla进行共同孵育，随着时间的延长，利用紫外-可见分光光度计可以看出探针在325 nm处的吸收逐渐地减弱，而在416 nm处的吸收峰则显著增强(图3a). 这些吸收上的变化显示出β-内酰胺酶对探针CFC-4的水解作用.

与此同时，对探针CFC-4在酶作用下的荧光变化也进行了记录. 从图3b可以看出，在TEM-1 bla的作用下，CFC-4的荧光强度得到了显著的加强，最大荧光增强比率可大于170倍以上. 这一荧光增强比率相比之前报道的CFC-2[9]而言，得到了极大的提高. 荧光增强比率对探针检测灵敏度非常重要：在同等条件下，荧光增强比率越高，检测灵敏度越高.

此外，研究发现，探针CFC-3自身在PBS中的稳定性较低，这对其进一步的应用带来了较大的困难，因此没有对其光学性质进行进一步的研究.

在此基础上，对探针在β-内酰胺酶的存在下随时间的荧光强度变化进行了考察. CFC-4在酶的作用下荧光强度持续升高(图3c). 作为参照，这个探针在没有酶的存在下，荧光强度基本不变，一直维持在一个非常低的水平. 在相同的条件下，探针CFC-2荧光增强的程度非常有限，甚至在开始阶段出现了一个荧光强度的下降(图3d).

图3 探针在β-内酰胺酶作用下的紫外-可见吸收与荧光的变化Fig.3 Changes of absorbance and fluorescence of CFC-4 in the absence and the presence of TEM-1 bla

这两个探针在酶的作用下荧光强度增强效率的巨大差异应该是由于这两个探针上二氟甲基的取代位置不同导致的. 对于探针CFC-2，由于实验中使用催化量的酶，缺乏足够的亲核基团，因此所得的酶水解后产物会迅速与水反应生成荧光强度较弱的醛取代的香豆素(8). 同样情况下，探针CFC-4生成的醛取代的香豆素(7)则具有非常强的荧光，因此体现为探针被酶水解后荧光强度的持续增加.

2.2 探针对β-内酰胺酶的标记分析

为了比较不同探针对β-内酰胺酶的标记效率，探针CDC-1、CFC-2、CFC-3、CFC-4分别与β-内酰胺酶TEM-1进行孵育后，进行凝胶电泳的荧光强度分析. 从图4中可以明显看出与探针CFC-4孵育后的TEM-1产生的荧光信号最强，与CFC-2或CFC-3共孵育后的TEM-1产生的荧光信号要明显弱于CFC-4. 另外，作为阴性对照，探针CDC-1由于不能在被酶水解后产生醌亚甲基，对酶不具备标记能力，因此在TEM-1蛋白条带中完全检测不到荧光信号. 以上结果充分证明了CFC-4比之前报道的CFC-2探针具有更好的对β-内酰胺酶TEM-1荧光标记能力.

为了验证以上探针荧光标记的特异性，进一步将这些探针与牛血清蛋白(BSA，一种对β-内酰胺抗生素完全不具备水解能力的蛋白)进行孵育并进行凝胶电泳的荧光强度分析. 在这些BSA蛋白条带中基本没有检测到荧光信号，这些结果表明了相关探针对BSA具有较好的稳定性，基本没有非特异性的标记. 另一方面，也证明了CFC-4对β-内酰胺酶标记的特异性，这一性质对探针在耐药病菌标记与检测的进一步应用具有非常重要的意义.

1: TEM-1 + CDC-1; 2: TEM-1+ CFC-3; 3: TEM-1 + CFC-4; 4: TEM-1 + CFC-2;5: BSA + CDC-1; 6: BSA + CFC-3; 7: BSA + CFC-4; 8: BSA + CFC-2a) 考马斯蓝染色成像；b) 荧光成像图4 TEM-1 β-内酰胺酶和牛血清蛋白与探针孵育后的凝胶成像 Fig.4 SDS-PAGE of TEM-1 bla and BSA after incubation with probes

2.3 探针对细菌的标记实验

在证明了探针CFC-4对β-内酰胺酶的标记效果的基础上，进一步对耐药病菌本身的标记进行研究.

探针CFC-4与表达β-内酰胺酶的E.coli.和β-内酰胺酶阴性大肠杆菌孵育1.5 h后，在紫外(365 nm)照射下可以发现只有β-内酰胺酶阳性细菌才能发出强荧光，并且在用PBS洗3次后仍然能看到较强的荧光信号，而与β-内酰胺酶阴性细菌孵育的样品则没有观察到荧光信号(图5). 作为参照，探针CDC-1同样只在β-内酰胺酶阳性细菌中呈现强荧光信号，但这一信号在被PBS洗3次后基本消失. 这些结果表明，CFC-4能够与β-内酰胺酶阳性细菌形成较为稳定的连接键，在被PBS洗涤后仍然能够确保稳定连接. 这将对耐药病菌的荧光标记起到非常关键的作用.

3 结语

利用活性醌亚甲基，发展了一个具有高效率的β-内酰胺酶荧光标记探针CFC-4. 这一探针在选择性地被β-内酰胺酶水解激活后可以释放出具有高反应活性的醌亚甲基并与酶上的活性亲核残基反应形成共价键，同时释放出强荧光信号，从而实现共价键荧光标记. 经过一系列酶、菌标记实验证明，CFC-4比之前发展的CFC-2荧光探针具有更好的标记效果和更强的荧光信号. 作为一种对耐药病菌选择性响应的探针分子，可以预期CFC-4在耐药病菌快速检测中具有良好的应用前景.

a) 洗前荧光成像；b) 洗后荧光成像图5 探针CFC-4对细菌的标记Fig.5 The labeling of bacteria with CFC-4