蛛网膜下隙注射miR-30b对脊髓Nav1.3表达及神经病理性疼痛的影响

茹靖涛，李 鸣，苏松雪，蔡伟华，曹 靖，臧卫东，邵金平

1)河南省人民医院骨二科 郑州 450003 2)郑州大学基础医学院人体解剖学系 郑州 450001

电压门控钠离子通道亚型1.3(voltage-gated sodium channels subtype 1.3，Nav1.3)由基因Scn3A编码，在啮齿类动物中主要表达于胚胎神经元，于孕17 d达到峰值，出生15 d后降低，30 d后仅微量表达。尽管在成年大鼠背根神经节(dorsal root ganglia DRG)中仅能检测到少量Nav1.3的表达，但在神经病理性疼痛时，DRG中的Nav1.3会重新高表达，并与神经病理性疼痛的发生发展密切相关[1-2]。然而Nav1.3参与神经病理性疼痛的调控机制尚不明确。microRNAs (miRNAs)是一类具有19～25个核苷酸的非编码RNA，其主要作用于转录后基因表达的调节。miR-30b是一个miRNA分子，参与癌症和神经退行性疾病等；通过生物信息学软件TargetScan预测miR-30b与编码Scn3A的3’UTR区碱基互补配对。本研究通过制作大鼠脊神经结扎(spinal nerve ligation，SNL)神经病理性疼痛模型，利用荧光定量PCR、免疫荧光染色和Western blot方法，探讨miR-30b调控Nav1.3 参与神经病理性疼痛的中枢机制。

1 材料与方法

1.1miR-30b与Scn3A靶标关系的验证

1.1.1 主要材料和试剂 本研究使用的miR-30b的类似物(agomir)、抑制剂(antagomir)、扰乱序列(scramble)以及重组野生型(WT)和突变型(Mut)pmirGLO双荧光素酶报告基因载体均由上海吉玛制药有限公司提供(野生型载体为携带与miR-30b配对的Scn3A 3’UTR区的质粒，而突变型为携带Scn3A 3’UTR区乱序的质粒)。

1.1.2 细胞的转染及分组 将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞以5×104mL-1接种于24孔板中, 置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养, 细胞密度达50%时用于转染。转染前3 h将细胞培养基换成不含血清的新鲜培养基。实验共分8组(每组均设3个复孔)：WT+scramble组(用脂质体转染法共转染野生型Scn3A 3’UTR载体和miR-30b的scramble序列50 pmol/L)、 WT+agomir组(共转染野生型Scn3A 3’UTR载体和miR-30b agomir 50 pmol/L)、WT+antagomir组(共转染野生型Scn3A 3’UTR载体和miR-30b antagomir 50 pmol/L)、WT+NC组(共转染野生型Scn3A 3’UTR载体和miR-30b antagomir阴性对照50 pmol/L)、Mut+scramble组(共转染突变型SCN3A 3’UTR载体和miR-30b的scramble序列50 pmol/L)、Mut+agomir组(共转染突变型Scn3A 3’UTR载体和miR-30b agomir 50 pmol/L)、Mut+antagomir组(共转染突变型Scn3A 3’UTR载体和miR-30b antagomir 50 pmol/L)和Mut+NC组(共转染突变型Scn3A 3’UTR载体和miR-30b antagomir阴性对照50 pmol/L)。共转染后，培养6 h，换为含体积分数10%血清培养基，继续培养48 h后收集细胞。

1.1.3 各组细胞中荧光素酶活性的检测 吸出待检细胞的培养基，PBS洗3次后，每孔加入100 μL裂解液，置于摇床振荡20 min，充分裂解细胞。12 000 r/min离心5 min。取上清20 μL，加入96孔白板，每样3个复孔，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)在Berthold Centro LB960 luminometer (Berthold Technologies)上检测萤火虫荧光强度与海肾素荧光强度的比值。

1.2大鼠SNL模型的制备及分组选用体重260～320 g的清洁级成年雄性SD大鼠(由河南省实验动物中心提供)。体积分数2%异氟烷麻醉后，剃除背部骶部区域的毛，取俯卧位，体积分数10%聚维酮碘消毒、铺巾，左侧后背部L2～S1处依次纵行切开皮肤、筋膜、肌肉，约3 cm长切口(距背中线1.0 cm)。钝性分离左侧棘突至骶骨的椎旁肌肉，充分暴露L4-6椎体侧缘和L5脊神经，结扎L5脊神经。假手术组则只暴露L5脊神经，其余过程同手术组。术后观察大鼠恢复情况，如出现神经功能障碍(如瘫痪)或状态不佳者，则剔除实验。实验共分4组(每组6只大鼠)：假手术组、SNL组(只进行SNL手术的大鼠)、SNL+scramble组[SNL大鼠鞘内置管注射miR-30b的扰乱序列(20 μmol/L，10 μL)，术后第10 天开始注射，连续注射4 d，1次/d]和SNL+agomir组[SNL大鼠鞘内置管注射miR-30b agomir(20 μmol/L，10 μL)，术后第10天开始注射，连续注射4 d，1次/d]。分别在术前1 d，术后第3、7和14天连续检测行为学变化。

1.3 4组大鼠双侧后肢机械痛敏和热痛敏的测定

1.3.1 4组大鼠50%缩足阈值(paw withdrawal threshold，PWT)的测定 采用经典von-Frey纤维，按Chaplan等[3]报道的方法测定。将大鼠置于金属网上，盖以透明的有机玻璃罩，先让大鼠适应环境20 min, 待大鼠的梳理和探究活动基本消失后，用一系列标准化的von-Frey纤维(0.407, 0.692, 1.202, 2.041, 3.630, 5.495, 8.511, 15.140 g)刺激大鼠后肢足底，直至纤维弯曲成“S”形，持续5 s，观察是否出现缩足反应。大鼠在刺激时间内出现快速的缩足反应，记为阳性反应，而身体活动所引起的缩足反应不记作阳性反应。应用Dixon[4]报道的方法推算出50% PWT。当50% PWT小于4 g时认为出现机械痛敏。

1.3.2 4组大鼠热缩足潜伏期(paw withdrawal latency，PWL)的测定 按照Hargreaves 等[5]报道的PWL测定方法，调整辐射热的强度，使大鼠PWL基础值保持在9～12 s，然后设定辐射光热测痛仪参数，设定热辐射照射时间极限为20 s。将大鼠置于有机玻璃板上, 盖以透明的有机玻璃罩, 让大鼠在透明框中自由活动20 min以适应环境，玻璃板的温度保持在(26.0±0.5) ℃，调节玻璃板下的辐射光源，使其对准大鼠后足掌心部，照射足底，大鼠出现缩足反应或照射时间达20 s，光源自动关闭，并自动记录时间。正常的大鼠PWL通常为9～14 s。每侧在同一部位测量3次，两次测量间隔10 min，取平均值。

1.4 4组大鼠脊髓背角组织中Scn3AmRNA和Nav1.3蛋白表达的检测术后14 d处死各组大鼠，取大鼠术侧L4-5脊髓背角组织，分别利用荧光定量PCR和Western blot的方法检测Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白的表达。

1.4.1 Scn3A mRNA表达的荧光定量PCR检测 Trizol法提取总RNA，利用M-MLV反转录酶获得cDNA。使用荧光定量PCR检测试剂盒[购自天根生化科技(北京)有限公司] 检测。PCR反应条件：预变性50 ℃ 2 min;变性95 ℃ 10 min，退火95 ℃ 15 s，延伸60 ℃ 30 s，40个循环。GAPDH为内参。采用2-ΔΔCt计算各目的基因的相对表达量。实验所用基因名称和引物序列见表1。

表1 基因名称和引物序列

1.4.2 Nav1.3蛋白表达的Western blot检测 将组织置于匀浆器中，加入 0.5 mL 细胞裂解液，手动匀浆至组织完全裂解，收集裂解液，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。BCA 法测蛋白质浓度，加入5×蛋白上样缓冲液，95 ℃加热10 min使蛋白质变性。SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转膜，封闭，一抗[兔抗大鼠Nav1.3抗体(按1∶300稀释，Abcam公司)和β-actin(按1∶1 000稀释)]孵育，4 ℃过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按1∶1 000稀释， Jackson公司)，室温孵育2 h，TBST洗膜后加入显色液，凝胶成像及分析系统中成像。以目的条带与β-actin的比值，再以假手术组进行标准化来表示蛋白水平。

1.5统计学处理采用SPSS 20.0进行分析。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组细胞中荧光强度、各组大鼠术侧脊髓背角组织中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表达的差异，应用重复测量数据的方差分析比较各组大鼠术前和术后不同时间后肢机械痛敏和热痛敏的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1miR-30b与Scn3A靶标关系的验证结果见表2。由表2可知，共转染WT Scn3A 3’UTR载体和miR-30b agomir(WT+agomir组)后荧光强度较转染WT+scramble组显著降低，差异有统计学意义。而共转染WT Scn3A 3’UTR载体和miR-30b antagomir对荧光强度无影响。此外，miR-30b agomir对突变体载体荧光强度的表达无影响。

表2 各组细胞中荧光强度的比较 %

*：F=91.840，P<0.001。△：与WT+scramble组相比，P<0.05；#：与Mut+agomir组相比，P<0.05

2.2各组大鼠双侧后肢机械痛敏和热痛敏的比较见表3。由表3可知，与假手术组相比，SNL组和SNL+scramble组的大鼠术后3、7和14 d术侧后肢50% PWT均降低，对侧后肢无明显变化。与SNL+scramble组相比，SNL+agomir组PWT升高，差异有统计学意义，而对侧后肢无明显变化。SNL组和SNL+scramble组大鼠术后3、7和14 d术侧后肢PWL较假手术组降低，而对侧后肢无变化。注射miR-30b agomir后，SNL大鼠术侧PWL延长，与注射scramble组相比，差异有统计学意义，而对侧热痛敏无明显变化。

表3 各组大鼠后肢机械痛敏和热痛敏的比较

*：与假手术组相比，P<0.05；#：与SNL+scramble组相比，P<0.05

2.3各组大鼠脊髓背角组织中Scn3AmRNA和Nav1.3蛋白表达的比较见表4。由表4可知，SNL组和SNL+scramble组大鼠术侧脊髓背角组织中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表达较假手术组增加。相反，在术后10 d，对SNL大鼠鞘内连续注射miR-30b agomir 4 d后，SNL+agomir组大鼠术侧脊髓背角组织中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表达降低，与SNL+scramble组相比，差异有统计学意义；提示SNL诱导的神经病理性疼痛可使脊髓背角组织中Nav1.3蛋白表达增加，而过表达miR-30b可降低SNL大鼠脊髓背角组织中Nav1.3蛋白的表达。

表4 各组大鼠术侧脊髓背角组织中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白的表达

*与假手术组相比,P<0.05;#:与SNL+scramble组相比,P<0.05

3 讨论

神经性病理疼痛的发病机制包括外周神经的兴奋性增高、中枢敏化、大脑下行易化等几个方面。脊髓的中枢敏化是其中的重要机制之一，研究其机制对治疗神经病理性疼痛至关重要。

脊髓的神经元表达多种离子通道蛋白，而离子通道功能的变化与神经元的兴奋密切相关，因此，研究在神经性病理性疼痛的状态下离子通道蛋白的变化对于疼痛机制的研究至关重要[6]。电压门控钠离子通道主要由 α亚基和 β亚基构成，其中 α亚基为功能亚单位,是介导钠离子出入的孔道，与神经细胞的兴奋性密切相关。现已发现的功能性电压门控钠离子通道包括9种亚型，分别为Nav1.1～Nav1.9；其中Nav1.3在胚胎的神经系统广泛表达，但在成年大鼠的神经系统几乎不表达[7]。尽管在成年大鼠DRG中仅能检测到少量Nav1.3的表达，但外周神经损伤后，其表达在DRG和患侧脊髓背角中均增加[1-2]。Hains等[8]研究显示在慢性压迫损伤大鼠神经病理性疼痛模型中，脊髓背角Nav1.3 mRNA和蛋白水平表达均上调，鞘内注射Nav1.3反义寡核苷酸可抑制Nav1.3的表达，同时缓解疼痛，这与作者的结果相一致。虽然已有研究[9]证实Nav1.3在神经病理性疼痛模型的脊髓重新高表达与疼痛的发生密切相关，但其升高机制并不清楚。本研究试图通过探索神经病理性疼痛发展阶段(7 d以后)脊髓Nav1.3高表达的相关机制，寻找抑制其高表达的方法，从而探寻对神经病理性疼痛治疗的新方法。

蛋白表达变化的调控机制有多种，包括转录前调控(如转录因子的变化、启动子区的甲基化调控等[10])和转录后调控(如内源性miRNA的调控、mRNA的甲基化等[11])。miRNAs是一类具有19～25 个核苷酸的非编码RNA，其主要作用为转录后调控。miRNA 和靶基因序列的互补程度决定了靶基因mRNA 在翻译水平被部分抑制或者断裂降解。当miRNA 与靶mRNA 完全结合时，靶mRNA 直接被降解；当不完全结合时，阻遏其翻译蛋白。这是哺乳动物基因表达在翻译水平抑制的主要方式。

基于Nav1.3在疼痛中的重要作用及在脊髓高表达的实验结果，本实验试图寻求能够调控Nav1.3的miRNA，探索抑制Nav1.3升高的新方法，为神经病理性疼痛的治疗提供新的镇痛靶点和方向。首先作者利用生物信息学软件TargetScan发现miR-30b与Scn3A的3’UTR区序列互补配对，通过构建重组与miR-30b互补的Scn3A的3’UTR双荧光素酶基因报告载体，在细胞水平验证了miR-30b可直接作用于Scn3A的3’UTR并负调控Scn3A的表达。为了检测在体给予miR-30b的镇痛效果，作者利用大鼠SNL神经病理痛模型，通过蛛网膜下隙给予miR-30b的类似物agmir过表达miR-30b，发现可以逆转脊髓中Nav1.3蛋白高表达，同时SNL模型的神经病理性疼痛行为也被反转。

上述实验验证了依靠在体转染试剂的帮助，miRNA的确可以转染到在体组织中，并发挥生物活性。而miRNA-30b抑制神经性病理疼痛的机制可能是通过直接作用于编码Nav1.3 mRNA的3’UTR区发挥转录后调控作用，从而抑制Nav1.3的表达所致。因此脊髓水平的Nav1.3有可能作为疼痛治疗的靶点，而蛛网膜下隙注射miRNA可望成为治疗疼痛的又一个新的手段。