脂肪干细胞对糖尿病大鼠勃起功能障碍的影响

王文华，葛永超，侯全亮，张程达，葛梦颍，田惠子，任炳楠，岳利敏，杜冰会，李丹康，赵青林，OPOLOT Godfrey，张卫东

1)郑州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系 郑州 450001 2)郑州第三人民医院泌尿外科 郑州 450000 3)美国密歇根州皇家橡树博蒙特卫生系统内科 底特律 48073

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是一种常见的男性性功能障碍性疾病[1]。据预测，2025年全球将有3亿2 200万男人患ED[2]。目前，临床上常用的治疗药物是5型磷酸酯酶抑制剂(phosphodiesterase 5 inhibitors，PDE5Is)[3],但是它可引起血压下降、消化不良、头痛等不良反应[4]。其他的传统治疗方法,如真空负压吸引装置、海绵体内药物注射、阴茎假体植入等因耐受性不良等得不到推广使用。干细胞疗法作为一种可能提高勃起功能的新方法,是目前医学领域研究的热点。这种类型的干细胞包括肌源性干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)等[5]。其中ADSCs是多能干细胞，具有创伤微小、取材容易等优点[6]。它可以分泌神经营养因子，促进神经再生[7]，可以诱导促血管生成因子分泌和受体的表达[8]，可分化成脂肪细胞、软骨细胞、肌源性和成骨细胞等且具有免疫抑制性[9-10]。本文建立糖尿病大鼠模型,通过海绵体移植ADSCs悬液,观察其对ED的治疗效果，探讨可能的生物学机制，为临床研究与应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组108只8周龄SPF级雄性SD大鼠，购自河南省实验动物中心[许可证号：SCXK(豫)2015-0004]。其中未作任何处理的20只大鼠为正常组。余88只大鼠腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液构建糖尿病模型。8周后，对随机血糖超过16.7 mmol/L的大鼠行阿扑吗啡(apomorphine，APO)实验[11]。将APO实验未观察到勃起的大鼠分为ED模型组和ADSCs治疗组。ED模型组海绵体移植PBS缓冲液，而ADSCs治疗组海绵体移植ADSCs悬液。

1.2ADSCs分离、培养ADSCs取自大鼠双侧腹股沟脂肪，并按照标准化方法[12]进行分离和培养。选用4周龄、体重60～80 g SPF级SD大鼠2只，无菌条件下取双侧腹股沟处脂肪，剪成糊状，加入相同体积的1 g/LⅠ型胶原酶溶液37 ℃消化40 min。经过3次低速离心后，按照105个/瓶的密度接种于25 cm2普通细胞培养瓶中，用含体积分数10%胎牛血清和青链霉素的高糖DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱内培养。细胞传代按文献标准化方法[13]进行。

1.3ADSCs增殖能力检测和成骨、成脂诱导使用MTT法检测ADSCs增殖能力，绘制生长曲线，计算3代ADSCs的倍增时间。取3代ADSCs进行成脂诱导、鉴定和成骨诱导、鉴定[14-15]。

1.4大鼠阴茎海绵体移植ADSCs取3代ADSCs，溶于PBS溶液，制成单细胞悬液。大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后以仰卧位固定并消毒会阴部，剪开阴茎包皮后游离阴茎海绵体，橡皮筋结扎阴茎根部，把100 μL的细胞悬液通过1 mL注射器注射至海绵体，2 min后松开橡皮筋，消毒、缝合切口。

1.5大鼠阴茎海绵体内压(ICP)及平均动脉压(MAP)测定治疗4周后，无菌条件下仰卧位固定麻醉后的大鼠，剪开腹部皮肤，定位海绵体神经和骨盆神经节。在大鼠的阴茎脚中插入肝素钠溶液(250 U/mL)的21-G针。与此同时，大鼠右侧颈总动脉的近心端和远心端分别用血管夹和细绳结扎。在颈总动脉的两个结扎处，显微镜剪将血管沿心脏方向剪开，将充满肝素钠溶液(250 U/mL)的大鼠颈动脉插管插入颈动脉。21-G针和插管都是通过PE管和三通管与压力换能器连接。压力换能器连接到MD 3000信号采集和处理系统。以复刺激参数为电压10 V，波宽0.2 ms，频率20 Hz的双钩状电极刺激大鼠海绵状神经，时间维持1 min，同时把血管夹松开，观察并记录ICP和MAP，计算ICP/MAP比值。

1.6免疫荧光染色检测vWF、α-SMA、nNOS蛋白的表达测量ICP和MAP后，取大鼠阴茎中段组织放入40 g/L的多聚甲醛固定18～24 h，5 μm厚度切片，脱蜡和抗原修复后行一抗孵育，一抗分别为山羊抗兔vWF(1∶500稀释后使用)、山羊抗小鼠 α-SMA(1∶500稀释后使用)、山羊抗兔nNOS(1∶200稀释后使用)，4 ℃过夜，切片清洗后加入二抗孵育，用DAPI复染细胞核3次，每次5 min。选用倒置荧光显微镜的视野观察组织切片，选取200倍的视野采集图像并进行拍照。选用Image Pro plus 6.0软件分析荧光图片。

1.7统计学处理应用SPSS 21.0分析。各组大鼠ICP/MAP以及阴茎海绵体vWF、 α-SMA、nNOS蛋白的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1动物模型基本情况最终有58只大鼠纳入分析，其中正常组有19只，ED模型组有19只，ADSCs治疗组有20只。

2.2ADSCs的鉴定用油红O染色成脂诱导后的ADSCs，可见脂滴呈鲜红色。成骨诱导后的ADSCs中，有大量钙化结节存在。

2.3各组大鼠阴茎海绵体ICP/MAP比较正常组、ED模型组、ADSCs治疗组大鼠ICP/MAP分别为(0.690±0.096)、(0.250±0.096)和(0.440±0.130)，差异有统计学意义(F=78.910，P<0.001)。ADSCs治疗组小于正常组，大于ED模型组。

2.4各组大鼠阴茎海绵体vWF、α-SMA和nNOS蛋白的表达结果见图1和表1。

A、B、C:分别为正常组、ED模型组和ADSCs治疗组图1 各组大鼠阴茎海绵体α-SMA(1)、nNOS(2)和vWF(3)蛋白的表达(免疫荧光染色，×200)表1 各组大鼠nNOS、α-SMA和vWF蛋白表达情况

组别nvWFnNOSα-SMA正常组190.25±0.030.33±0.080.06±0.02ED模型组19 0.04±0.06*0.08±0.07*0.02±0.02*ADSCs治疗组200.18±0.11*#0.25±0.08*#0.05±0.04*#F11.72214.8333.943P0.0020.0010.048

*:与正常组相比，P<0.05；#:与ED模型组相比，P<0.05

3 讨论

有研究[11-20]表明，ADSCs可以通过改善阴茎血管内皮的功能、修复海绵体平滑肌细胞和内皮细胞等途径改善大鼠勃起功能。同时，Fandel等[21]指出ADSCs通过从海绵体转移到受损海绵体的神经，进而促进神经修复。以上结果提示ADSCs在治疗ED方面有很多优势。

作者采用了ICP/MAP来评价实验结果。臧光辉等[19]的研究结果表明，刺激时的电压水平会影响大鼠的ICP，并且随着电压的增大，大鼠ICP也增大。作者也发现，ICP的值会随着血压变化而变化，所以评价大鼠勃起功能时采用了大鼠ICP/MAP这个指标。

阴茎勃起与阴茎海绵体的神经、海绵体的内皮和海绵体的平滑肌等都有关[22]， vWF是海绵体内皮标志物，α-SMA是阴茎海绵体平滑肌标志物，nNOS可以反映出海绵体神经情况，也可以反映出和NO分泌相关神经纤维的情况。作者的研究结果发现，ADSCs可以增加大鼠阴茎海绵体vWF、α-SMA和nNOS蛋白的表达，提示移植入海绵体的ADSCs分化成了内皮、平滑肌和神经纤维等，促进了大鼠勃起功能的复苏。

作者发现如果移植过多的液体，大鼠阴茎海绵体会出现严重的水肿。为了达到减轻水肿的目的，把细胞溶解在了100 μL PBS溶液中，这也是本研究优于其他方案的地方。

总之，ADSCs可以提高糖尿病大鼠的勃起功能，并可以提高大鼠阴茎海绵体vWF、α-SMA和nNOS蛋白的表达。