氨苄青霉素残留免疫学检测方法研究进展

张岩蔚，张冬昊，李佳仪，何 扩，魏 东

(1. 河北北方学院食品安全研究中心，河北张家口075000 ； 2. 河北省农产品安全检测重点实验室，河北张家口075000)

随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品安全问题已成为关乎人类身体健康和社会和谐的重要问题。由于抗生素的大量使用，动物源性食品中的兽药残留问题已经引起了全社会的关注。

青霉素(Penicillin)类药物是历史最悠久的抗菌素，是由青霉菌中提炼出的抗生素，其分子中含有青霉烷，能破坏细菌的细胞壁，并在细菌的繁殖期间有着杀菌的作用。青霉素属于β-内酰胺类抗生素，因其效率高、毒性低等特点[1]，被广泛应用，其中氨苄青霉素是畜牧养殖过程中常用的青霉素类药物之一，它是在青霉素G侧链羧基的α位引入氨基(图1)，改变其极性，是半合成的青霉素，对革兰阴性菌和阳性菌均能产生不同程度的抑制作用[2]。由于氨苄青霉素耐酸不耐酶的特性，避免了天然青霉素不宜内服的缺点，在临床中得到了广泛的应用[3]，主要被用于治疗链球菌和金黄色葡萄球菌感染的如乳腺炎、脓肿、败血症，以及其他细菌、真菌感染的如炭疽、破伤风、关节炎、放线菌病等畜禽常见疾病。

图1氨苄青霉素分子结构

氨苄青霉素注射后吸收迅速，血药浓度较高，但下降也快。就注射的起始浓度而言，皮下注射或肌肉注射均较低，即使增加注射量也达不到静脉注射所产生高的血药浓度。氨苄青霉素吸收后分布均匀，用药之后在有炎症的脑脊液、胸腹水等均可达到有效的药浓度[4-5]，其中胆汁中药物浓度远比血药浓度高。

然而随着氨苄青霉素的大量使用，使得动物体内的耐药致病菌很容易感染人类，人们长期食用含氨苄青霉素残留的动物源性食品后，可造成药物蓄积，当达到一定浓度后便会对人体产生毒性作用，如过敏、“三致”(致畸、致癌、致突变)作用等。2006年，高建新[6]等人对江西省市售的进口、国产的婴幼儿奶粉以及液态奶中的抗生素残留进行了调查，结果发现：国产的和进口的婴幼儿奶粉抗生素检出率分别为34.40%和0.00%，液态奶的检出率为15.27%。2015年，Attaie R[7]等发现牛奶中含有多种抗生素等。氨苄青霉素残留影响着动物源性食品的安全以及畜牧业的可持续发展，直接或间接危害了人类的身体健康和生命安全，对人类的危害极其之大。因此，检测氨苄青霉素残留是当前检测动物性食品安全的重要指标之一，而准确、快速、大批量的检测方法便成为现在最受欢迎的检测方法。

目前，国内外用于检测氨苄青霉素残留的方法有很多，主要有理化检测法、微生物检测法和免疫分析法[8]。高效液相色谱-串联质谱法是一项高效、准确、灵敏的检测技术，可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物，也用于各种离子的分离分析，从而进行准确的定性分析或者精确的定量分析，适用于残留药物的确证；微生物检测法是检测抗生素残留较为传统的一种方法，主要是根据抗微生物药对特异性微生物的生理功能以及代谢过程的抑制作用来定量或定性检测样品中残留的抗微生物药类[9]；免疫分析法是根据抗原或半抗原与相应抗体可发生特异性结合的性质，利用酶或其他有色、发光物质对特定抗体(或抗原)标记使其作为选择性试剂对相应待测抗原(或抗体)进行定性或定量分析的一种方法。

由于HPLC-MS法前处理较复杂，所用仪器也较昂贵，并且需要专业的检测人员进行操作，难以实现大量样品的现场快速检测，因此不易进行普及；微生物检测法虽然原理和操作过程较简单，适合于药物的快速筛选，但是由于其时间长、检测限过高、灵敏度过低、特异性差，因此也不能大量的推广；而免疫分析法中，由于抗原与抗体分子间具有高度互补的立体化学、氢键、范德华力和疏水区域的综合作用，因此具备了任何单独的一种理化分析技术都难以达到的高选择性、高特异性和高灵敏度，并且检测过程中特别是前处理阶段十分简单，在大批量、复杂的介质中依旧能进行微量痕量组分的检测，检测速度快，是一种检测成本低且相对独立的快速检测方法[10]，适合于现场大量样品的快速筛选，因此被广泛应用。

本文主要对氨苄青霉素残留检测的必要性和对氨苄青霉素的免疫学检测方法进行了分析。

1 氨苄青霉素残留的危害及检测的必要性

1.1 氨苄青霉素残留的危害 氨苄青霉素解决了人类的许多问题，如治疗消化道、呼吸道感染等，同时也在治疗动物疾病、促进动物生长以及畜产品质量等方面起到了重要作用。但是，随着氨苄青霉素的广泛应用，总有部分人为了追求更好的治疗效果，常出现药物滥用或超剂量使用的现象，最终导致动物源性食品中出现严重的药物残留[11]，人长期食用含氨苄青霉素残留的动物性食品后，可造成药物蓄积，当达到一定浓度后便会对人体产生毒性作用，同时还会对畜牧的发展产生一定的影响，主要有以下几种：

1.1.1 细菌耐药性增强 动物机体长期反复食用含有某种抗菌药物的饲料后，其体内敏感菌株受到选择性的抑制，使机体内的耐药菌株大量繁殖。而这些含有抗生素残留的动物源性食品被人食用后，人体也会产生耐药性菌株，同时动物体内的耐药菌株的耐药性也有可能转移到人体中，使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效，治愈难度大大增加[12]。以前机体感染某种病菌，只要服用针对这种病菌的抗生素便可治愈，而现在这种病菌具有多种抗药性基因，一种抗生素已经起不到作用，必须多种抗生素同时使用才能治愈[13]。

1.1.2 过敏反应 长期食用抗生素超标的动物源性食品，会使部分人群发生过敏反应，轻者出现恶心、呕吐、皮疹、血压下降、呼吸困难等症状，严重时会导致过敏性休克甚至危及生命。青霉素类药物引起的过敏性反应主要有接触性皮炎和皮肤反应、胃肠道紊乱引起的恶心、呕吐等。氨苄青霉素属于半抗原，不能使机体产生相应的抗体，但它进入体内后很容易发生降解或者与蛋白发生反应生成完全抗原，进而使机体产生相应的抗体[14]。当这些被致敏的人长时间使用氨苄青霉素超标的动物源性食品后，机体中的抗体便会和氨苄青霉素结合生成抗原抗体复合物，从而致使人发生过敏反应，过敏性反应一般发生在用药后20 min内。

1.1.3 肠道菌群失调 人体内正常会寄生着大量的菌群，主要分为敏感菌和不敏感菌两种，它们的存在对身体的健康起着重要的作用[15]。一旦机体长期与动物源性食品中残留抗生素接触，就会使一些敏感性非致病菌被抑制或死亡，不敏感的耐药菌或条件性致病菌大量生长繁殖导致双重感染，扰乱肠道微生物平衡，从而导致长期的腹泻或引起维生素的缺乏等反应，同时还容易造成病原菌的交替感染，使得具有选择性作用的抗生素及其他化学药物失去疗效。

1.1.4 影响乳制品的发酵 氨苄青霉素对热的稳定性比其他常用的抗生素都好，一般的加热杀菌根本起不到破坏作用[28]。从乳品加工的角度来看，原料乳中抗生素残留严重干扰发酵乳制品的生产，可严重影响干酪、黄油、发酵乳的起酵和后期风味的形成[16]。酸牛乳生产过程中所用的发酵剂嗜热链球菌是一种乳酸菌，青霉素对其的抑制最为强烈，一般情况下，当青霉素含量达到0.05 IU/mL～0.10 IU/mL时便会影响乳酸菌的生长繁殖，而含量达到1 IU/mL时乳酸菌的生长会被完全抑制[17]，牛乳酸化凝结进程明显变慢。

1.1.5 影响畜牧的正常发展 长期滥用抗生素严重制约着畜牧业的健康持续发展，如长期使用抗生素容易造成畜禽机体免疫力下降，影响疫苗的接种效果；还可引起畜禽内源性感染和二重感染；使得以往较少发生的细菌病(大肠埃希菌、葡萄球菌、沙门菌)转变成为家禽的主要传染病。此外，耐药菌株的增加，使有效控制细菌疫病变得越来越困难。

1.2 氨苄青霉素残留检测的必要性 氨苄青霉素残留影响着动物源性食品的安全以及畜牧业的可持续发展，直接或间接危害了人类的身体健康和生命安全，对人类的危害极其之大，最后的结果也是十分严重。因此，想要让人们放心的食用动物源性食品，必须完善畜产品安全质量的保障措施，对动物源性食品的兽药残留进行检测和监管，进而对有害的动物性食品进行处理，防止其流入市场。加强氨苄青霉素药物的监控，重点搞好药物的残留检测及分析方法，对保障畜产品质量、维护人体健康、保护人类赖以生存的生态环境具有重要意义[18]。世界各国对氨苄青霉素在动物源性食品中制定了最高残留限量(MRL)。欧盟药典规定的氨苄青霉素残留限量标准4 μg/kg，1997年日本制定了抗生素在牛奶中的MRL为0.1 mg/kg，我国农业部2002年也规定了氨苄青霉素在牛奶中的MRL是10 μg/kg，在可食组织中的MRL为50 μg/kg[19]。虽然我国制定了《动物性食品中兽药最高残留限量》以及《饲料药物添加剂使用规范》，但是抗生素残留现象依旧十分严重，建立一种准确、快速、简便的氨苄青霉素残留免疫检测方法是十分必要的。

2 氨苄青霉素残留的免疫检测技术

免疫反应即是抗原-抗体反应，其最大特点是具有高灵敏度和强特异性，抗原抗体复合物的亲和指数通常为109或者更高。免疫检测技术主要是以抗原与抗体的特异可逆性结合反应为基础的检测技术。

氨苄青霉素是一种小分子的半抗原，虽然能够与抗体结合，但是不能刺激机体产生相应的抗体，必须和一种载体蛋白结合，偶联成为全抗原后才能作为免疫原免疫小鼠。载体蛋白物质由于分子量较大，并且有较好的异源性，与兽药偶联后可使动物的免疫系统发生应答反应，其主要有牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HAS)等。然而在选择载体蛋白时，应尽量减少蛋白造成的背景干扰[20]。为了防止蛋白的结构发生变化，应在条件温和的水溶液中进行小分子物质与载体蛋白的偶联反应，尽量避免高温、强酸碱等极端环境。

氨苄青霉素和大分子蛋白质偶联主要有两种方式：第一种是利用待测兽药上已有的活性基团(-COOH、-NH2、-OH、-SH、卤素等)，通过双功能试剂，如NH2(CH2)nC(x)H、戊二醛、琥珀酸酐等，引入连接臂和活性基团，使之与载体蛋白偶联，此方法比较容易实施，但是如果这些活性基团代表着其特征结构或偶联后改变了分子的电子分布，便会影响抗体对待测兽药的识别；第二种方法是直接合成带有-(CH)nCOOH、-(CH)nNH2等结构的待测兽药的衍生物，这种方法有利于保护待测兽药的特征结构，使分子的电子分布不受影响，但是合成过程较复杂，一般需要多步反应才能合成[21]。偶联的方法一般由半抗原上的活性基团所决定，主要有碳二亚胺法、戊二醛法、琥珀酸酐法、混合酸酐法、重氮化法等，其中碳二亚胺法、混合酸酐法用于羧基半抗原与载体的偶联，戊二醛法、重氮化法用于氨基半抗原与载体的偶联，琥珀酸酐法用于带有羟基的半抗原与载体的偶联。

目前常用的免疫分析方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光免疫检测方法(FIA)、胶体金免疫层析法(CGIA)、免疫传感器分析法(ISA)等。

2.1 酶联免疫吸附法(ELISA) 酶联免疫吸附法是酶免疫测定技术中应用最广的技术，主要是以固相材料为载体来吸附抗原或抗体的一种免疫分析方法，最早在1971年由Weemen和Perlmann分别提出，该方法具有灵敏度高、特异性好、检测成本低、检测速度快等优点，已被广泛应用于医学、环境科学、生物、化学等方面。该方法主要是将抗原或抗体结合到某种固相载体的表面，使其保持免疫活性，然后将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既有酶的活性又具有与固相载体表面抗体或抗原特异性结合的活性，最后加入酶的底物，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与样品中被检物质的量具有直接的关系，所以可以根据颜色的深浅来进行定性或定量分析。根据抗原抗体反应的机理不同，ELISA可分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法4种，其中双抗体夹心法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原；竞争法可用于抗原和半抗原的测定，也可用于抗体的测定，其测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。

陆彦[10]采用碳二亚胺法将氨苄青霉素与匙孔嘁血蓝蛋白(mc KLH)偶联制备免疫抗原，与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备包被抗原，利用间接酶联免疫吸附法对Amp-KLH 偶联物免疫小鼠产生的抗体进行检测，建立了对氨苄青霉素的ELISA检测方法。采用间接竞争 ELISA 方法建立检测 Amp 的标准曲线，在0.5 ng/mL～100 ng/mL 范围内呈线性相关，回归方程为 y=0.0569x+0.1308，R2=0.9948。

张正挺等[22]利用竞争法将青霉素酶包被在酶标板上，通过氨苄青霉素与辣根过氧化物酶的连接制备了酶结合物，经过配方的优化开发出检测牛乳中氨苄青霉素含量的检测试剂盒，其灵敏度达到了4 μg/kg。

2.2 荧光免疫检测方法(FIA) 荧光免疫检测方法作为免疫分析法的一种，由于荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但在实际工作中荧光抗原技术应用很少，因此，也被称为荧光抗体技术。抗体与荧光素结合后并不影响其与相应的抗原发生特异性反应，用荧光素标记的抗体与切片中组织细胞中的抗原相结合，若荧光标记抗体与相应抗原发生特异性结合反应，则洗涤分离后不会被缓冲液冲掉，然后用荧光检测仪观察抗原抗体复合物的特异性荧光强度，进而对样品中微量或超微量物质进行定量测定。FIA操作简单，现象直观，可进行示踪观察，具有专一性强、灵敏度高等特点，被用于测量含量较低的生物活性化合物。荧光免疫检测方法主要分为非均相荧光免疫测定和均相荧光免疫测定，其中非均相荧光免疫测定又包括时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)和荧光酶免疫测定，均相荧光免疫测定包括荧光偏振免疫测定(FPIA)等。由于荧光免疫分析法背景荧光干扰较大，因此需选择合适的荧光试剂以及合适的样品处理方法以减少非特异性吸附蛋白的影响。

王云云[23]选择荧光发射波长分别为520 nm、565 nm和610 nm的3种量子点通过共价键偶联作用分别标记链霉素、四环素和青霉素G的抗体，从而获得3种量子点抗体探针,即OD520-抗链霉素抗体、OD565-抗四环素抗体和OD610-抗青霉素G抗体，以3种量子点抗体探针为基础建立了直接竞争荧光免疫分析法，通过对免疫条件的分析得到最佳条件，采用阵列分析模式实现了对链霉素、四环素和青霉素G的同时灵敏的可视化检测，研究出3种抗生素检测的线性范围分别为0.01～25 ng/mL、0.01～25 ng/mL和0.01～10 ng/mL，检测限均达到了0.005 ng/mL。本研究建立的方法比其他分析牛奶中相应3种抗生素的方法具有更高的灵敏度和准确度。

2.3 胶体金免疫层析法(GICA) 胶体金免疫标记技术创于20世纪70年代，主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处可在显微镜下看到黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时可肉眼看见红色或粉红色斑点。由于胶体金具有肉眼可观测的红色，便以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。胶体金免疫层析法是胶体金标记技术和蛋白质层析技术的结合，是以条状纤维层析材料为固相，将各种反应试剂分点固定在测试板上，通过毛细管作用使样品溶液在层析条上移动，使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体发生高特异性和高亲和性的免疫反应，形成的复合物被富集或固定在层析条上的特定区域(检测线)，通过酶反应或直接形成肉眼可见的标记物胶体金，一般只需几分钟就能得到准确结果。胶体金免疫层析检测技术具有使用方便、检测时间短、稳定性好以及生产成本和检测成本均较低等优点，在临床医学检测、激素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速检测以及抗原抗体分析等诸多领域有着迅速的发展。

张鸿等[24]利用鞣酸还原法制得的胶体金标记氨苄青霉素单克隆抗体，对建立胶体金免疫层析快速检测氨苄青霉素残留方法进行研究。成品试纸条PBS中氨苄青霉素的检测限为50 ng/mL，牛奶加标样品中氨苄青霉素的检测限为100 ng/mL，检测范围在0～1 000 ng/mL。

孙志文等[25]应用胶体金免疫层析法对牛奶中的β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺残留进行检测，结果表明，其检测限分别为青霉素G 2 μg/L、氨苄青霉素3 μg/L、阿莫西林4 μg/L、邻氯青霉素6 μg/L、双氯青霉素6 μg/L、三聚氰胺50 μg/L，假阳性率不大于5%，假阴性率为0，特异性好，与牛奶中其他抗生素无交叉反应。

2.4 免疫传感器分析法(ISA) 免疫传感器作为一种新兴的生物传感器，主要以鉴定物质的高度特异性、敏感性和稳定性的特点受到人们广泛的青睐。它是将传统胡免疫测试和生物传感技术结合起来，将两者的优点采纳，不仅减少了分析时间、提高了灵敏度和测试准确度，也使得测定过程变得简单，易于实现自动化操作，减少了对使用者及环境技术条件的依赖，在现场或野外进行快速筛选测定有着广阔的应用前景。传感器的生物敏感层与复杂样品中待测的目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识别功能，产生一些物理化学信号，如颜色、光、热、电化学等变化，通过不同原理的传感器，如光敏管、热敏电阻、压电装置、光极、离子选择性电极等将其转换成第二信号，经放大后显示结果或记录。利用氨苄青霉素与特异性抗体结合反应的特性研制出的免疫传感器，可用于氨苄青霉素药物残留进行快速定量定性检测[3]。

王明华等[26]针对动物性食品安全问题中的青霉素兽药残留快速检测的免疫传感器分析法进行研究，主要关注直接固定抗体、直接检测方法的性能稳定性。通过采用分子模拟的研究方法对其可能的影响操作步骤和检测条件-牛血清白蛋白封闭的过程进行深入探索，以固定抗体的活性，改进免疫传感器的构建方式，获得较稳定的性能。免疫传感器采用硫辛酸自组装单分子层膜将氨苄青霉素抗体固定于压电金电极上作为生物识别元件、以石英晶体微天平作为检测器构建，对不同封闭过程产生的影响进行研究，比较免疫传感器实物试验与分子模拟的研究结果。

张婉洁等[27]提出了一种新的利用基于表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)的生物光学传感器检测多种残留物的方法。通过引入分子标记技术，在修饰有羧甲基葡聚糖的芯片表面固定一层抗分子标记物BSA的抗体，通过对待测样品的孵育，使其对多种残留物的检测转化为对同一标记物的检测。使用分子标记物BSA对卡那霉素、三聚氰胺、氨苄青霉素和链霉素进行标记，并对其水溶液进行检测，检测限分别为50 μg/L，10 μg/L、1.25 μg/L 和10 μg/L，均低于各自的最大残留检测限(MRL)。该检测方法解决了竞争抑制法在检测时传感器专一性的问题，实现了传感器的通用性，同时也可以推广到其他免疫法检测的领域，使免疫传感器、免疫试纸等通用性增强。

3 展望

氨苄青霉素是治疗动物疾病的常用β-内酰胺类抗生素类药物之一，在动物源性食品中的残留对人类有着严重的危害，因此AMP残留的检测越来越受到重视，选择特异性强、灵敏度高、高效快速的检测方法尤其重要。传统的检测方法样品前处理较复杂，并且需要大型仪器，而免疫分析技术的引用解决了这些问题，实现了在线、实时、检出限低、灵敏度高、选择性好、可大批量制备的快速检测。例如ELISA法的取样量小、前处理简单，不需要大型仪器，检出限与HPLC-MS不相上下，而分析效率则是HPLC-MS的几十倍以上。目前国内外已经有许多商品化的试剂盒，取得了巨大的成就，但是还存在难以实现商业化的问题。随着科学技术的日益进步，试验仪器的便捷化、微型化成了检测方法的发展趋势，免疫学检测技术在氨苄青霉素药物残留检测方面必然会有更广阔的发展和应用前景。