冻融胚胎移植周期中围种植期雌二醇监测的意义

姬萌霞，邢莉莉，金碧辉，余芝芝，傅晓华，吴瑞芳，黄琼晓，舒静

(浙江省人民医院/杭州医学院附属人民医院生殖内分泌科，杭州 310014)

冻融胚胎移植(FET)因其有避免卵巢过度刺激、提高累积妊娠率等优点逐渐成为辅助生育技术(ART)中重要的治疗策略。近年来，ART领域的关注点逐渐由单一追求妊娠率转移到安全性与成功率兼顾，选择性单胚胎移植和全胚冷冻策略逐步开展，这促使FET周期大大增加[1]。FET的关键在于准备容受性良好的内膜，而雌、孕激素在调控子宫内膜容受性上起重要作用。影响FET结局的因素有很多，从胚胎角度讲，包括女方年龄、移植胚胎数目、胚胎级别等；从内膜角度讲，包括内膜厚度、内膜准备的用药方案、种植窗期间雌、孕激素水平等[2]。子宫内膜仅在特定的时间内允许胚胎植入，称为“种植窗”，通常在受精后3～5 d内。而种植窗的开启与关闭主要受雌、孕激素的调控。那么，在FET过程中，有必要监测雌、孕激素水平吗？有学者认为，雌激素过高或过低均可能影响胚胎种植[3]；也有学者认为，雌激素浓度不影响妊娠率[4-5]。本文拟探讨围种植期雌激素对FET结局的预测价值。

资料与方法

一、研究对象

2016年1月至2017年12月于我中心行FET的362个周期，根据内膜准备方案不同分为激素替代组和自然周期组。患者平均年龄为(32.30±4.32)岁，不孕年限(3.91±2.73)年。

二、内膜准备

1.自然周期方案：适用于月经周期较规律、无排卵障碍的患者。于月经周期第9～10天起行B超监测卵泡，直至排卵日。排卵日记为Day 0，开始给予黄体酮针剂(浙江仙琚制药)转化内膜，40 mg qd；Day 1起予地屈孕酮片(达芙通，雅培制药，荷兰)10 mg bid；Day 3行卵裂期胚胎移植；Day 5行囊胚移植。

2.激素替代方案：适用于月经周期不规律或排卵障碍的患者。于月经周期第3天行B超检查，如无影响移植的盆腔异常情况，予戊酸雌二醇片(补佳乐，拜耳，德国)，3 mg，bid，定期B超监测子宫内膜形态及厚度，必要时加用17β-雌二醇片(芬吗通，雅培制药，荷兰)阴道上药，用药12天以上且内膜厚度≥ 8 mm时予孕激素转化内膜，转化日记为Day 0，予黄体酮针剂(浙江仙琚制药)40 mg，qd；Day 1起予地屈孕酮片10 mg bid；Day 3行卵裂期胚胎移植；Day 5行囊胚移植。

两种方案均于移植日B超测量内膜厚度及形态，检测移植日及移植后第3天血雌二醇(E2)、孕酮(P)，计算移植日及移植后第3天P/E2。P/E2=P(nmol/L)×1 000/E2(pmol/L)。比较临床妊娠组与未妊娠组的种植率和移植日、移植后第3天E2、P水平及P/E2；以移植后第3天E2367 pmol/L为界值，分为E2≤367 pmol/L和E2>367 pmol/L两组，比较两组的FET结局。

三、胚胎冷冻及复苏

取卵后72 h观察胚胎生长情况，必要时行囊胚培养，根据临床需要进行胚胎冷冻。卵裂期胚胎分级标准如下：Ⅰ级胚胎：卵裂球大小均匀，无碎片或仅有极少(<10%)碎片；Ⅱ级胚胎：卵裂球大小略不均匀，碎片率为10%～20%；Ⅲ级胚胎：卵裂球大小明显不均匀，碎片率21%～50%；Ⅳ级胚胎：卵裂球大小严重不均匀，碎片率≥50%。优质卵裂期胚胎定义为第3天6细胞以上的Ⅰ、Ⅱ级胚胎；可利用卵裂期胚胎定义为第3天4细胞以上的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎。囊胚分级以Gardner分级为标准[6]，优质囊胚定义为第5天囊胚级别在3BB以上，第6天囊胚级别在4BB以上。冷冻标准包括优质卵裂期胚胎、可利用卵裂期胚胎及囊胚。冷冻及复苏方法均为玻璃化冷冻。胚胎复苏时，存活细胞数>50%即为复苏成功，行胚胎移植。

四、妊娠判定及观察指标

胚胎移植12 d查血HCG，移植后35 d行阴道B超检查。血HCG>5 U/L定义为HCG阳性，HCG阳性但宫内外均未见孕囊定义为生化妊娠，B超下见孕囊定义为临床妊娠。种植率=B超下孕囊数/移植胚胎数×100%，临床妊娠率=临床妊娠周期/移植总周期数×100%，生化妊娠率=生化妊娠周期/移植总周期数×100%。

五、激素测定

采用电化学发光法测定E2和P，试剂盒为BECKMAN机器专用，按试剂盒说明进行操作。

六、统计学分析

所有数据均采用SPSS 21.0 统计软件处理。符合正态分布的计量资料用(±s)表示，采用独立样本t检验。计数资料用率表示，采用χ2检验。以P<0.05差异有统计学意义。

结 果

一、FET临床妊娠与未妊娠两组比较

激素替代方案共有239个周期，其中临床妊娠128个周期，未妊娠111个周期，两组患者在移植日内膜厚度、移植日E2、P、P/E2，移植后第3天E2、P、P/E2等方面均无显著性差异(P>0.05)，但临床妊娠组移植胚胎数及优胚数显著高于未妊娠组(P<0.05)(表1)。

自然周期方案共有123个周期，其中临床妊娠70个周期，未妊娠53个周期，两组患者在移植日内膜厚度、移植日E2、P、P/E2，移植后第3天E2、P、P/E2，移植胚胎数及优胚数等方面均无显著性差异(P>0.05)，但临床妊娠组移植后第3天E2水平显著高于未妊娠组(P<0.05)(表2)。

表1 激素替代方案临床妊娠与未妊娠组比较(x-±s)

注：与临床妊娠组相比，*P<0.05

表2 自然周期方案临床妊娠与未妊娠组比较(x-±s)

注：与临床妊娠组相比，*P<0.05

二、移植后第3天不同E2水平FET结局比较

以移植后第3天E2水平367 pmol/L为界值分为两组进行比较。激素替代方案中，两组平均年龄、移植日内膜厚度、移植胚胎数、移植优胚数、种植率、生化妊娠率均无显著差异(P>0.05)；E2>367 pmol/L组的临床妊娠率高于E2≤367 pmol/L组，但差异无显著性(P>0.05)(表3)。

自然周期方案中，两组平均年龄、移植日内膜厚度、移植胚胎数、移植优胚数等均无显著性差异(P>0.05)。E2>367 pmol/L组的种植率、临床妊娠率高于E2≤367 pmol/L组，而生化妊娠率低于E2≤367 pmol/L组，差异有显著性(P<0.05)(表4)。

表3 激素替代方案移植后第3天不同E2水平FET结局[(x-±s)，%]

表4 自然周期方案移植后第3天不同E2水平FET结局[(x-±s)，%]

注：与E2≤367 pmol/L组相比，*P<0.05

讨 论

既往研究常常关注内膜转化日、移植日这一种植窗开启前期雌、孕激素水平对妊娠率的影响，而针对于移植后第3天，即种植窗即将关闭、黄体中期时雌、孕激素水平的研究较少。本文着重于研究移植后第3天的雌孕激素水平能否预测胚胎种植率和妊娠率，监测移植后第3天的雌孕激素水平是否有意义，具有一定的创新性。

影响FET结局主要因素有内膜和胚胎两个方面。有研究认为内膜厚度在8 mm以上，移植优胚数较高，妊娠率增加[2]。本研究中，激素替代方案的妊娠组与未妊娠组内膜厚度、雌孕激素水平无显著差异，但移植胚胎数、移植优胚数显著高于未妊娠组，提示胚胎因素可能是影响两组结局的主要原因；但是在自然周期中，妊娠组与未妊娠组移植胚胎数、移植优胚数、内膜厚度无显著差异，妊娠组移植后第3天雌激素水平显著高于未妊娠组，提示激素水平可能是影响两组结局的主要原因。

卵泡期时，E2可促进内膜增殖，那么在内膜准备过程中，是否需监测E2以调整用药？围种植期的E2浓度是否与妊娠率相关？Ma等[3]对小鼠模型的研究发现，雌激素过高或过低均可能影响胚胎种植，较低雌激素水平会延长种植窗时间，而高雌激素水平会促进种植窗的关闭。但也有研究认为，调控人类种植窗的雌激素浓度范围较广，血清E2为50 pg/ml(183 pmol/L)时就足以开启和维持种植窗，它对内膜更像是一种允许作用而非剂量调节作用[7]。项云改等[4]研究发现，移植日E2<734 pmol/L组与>734 pmol/L组间妊娠率无显著差异；牛志宏等[5]发现在激素替代周期方案中，转化日E2浓度小于495.4 pmol/L与高于495.4 pmol/L，妊娠率同样不受影响。我们的研究也发现，无论是激素替代周期还是自然周期，妊娠组和未妊娠组移植日的E2水平并无显著差异。由此可见，在内膜准备过程中，监测E2浓度似乎并无意义。

移植后第3天是黄体成熟、孕激素分泌达到高峰、雌激素分泌达到第二高峰的时期。此时较低的雌激素水平是否会影响种植率和妊娠率？一些研究认为，在新鲜移植周期中，黄体期E2水平大幅下降不利于胚胎种植[8-10]。那么，在冻胚移植周期中，黄体期E2是否会影响妊娠率？本研究发现，自然周期方案中，未妊娠组移植后第3天E2水平显著低于妊娠组。此外，移植后第3天E2≤367 pmol/L的患者和>367 pmol/L的患者相比，种植率和临床妊娠率显著降低，生化妊娠率显著上升；在激素替代方案中，妊娠组与未妊娠组移植后第3天E2水平无显著差异。以367 pmol/L为界值，两组妊娠率和种植率无显著差异。有研究发现，孕激素受体(PR)的合成需要适量的雌激素。E2水平过低会导致PR合成不足，进而造成黄体功能下降，影响胚胎种植[11]。自然周期中，黄体期雌、孕激素的水平由自身黄体决定，不受外源性激素影响。移植后第3天的E2水平下降可能预示黄体功能不足，胚胎种植率下降，进而导致临床妊娠率下降。而激素替代周期在移植前后均给予大量外源性雌激素，推测移植后第3天较低的血清E2水平不一定代表体内真实的雌激素状态，因此对预测妊娠率和种植率的意义不大。但本研究样本量较小，移植后第3天E2水平在自然周期冻胚移植中的意义以及移植后补充雌激素的必要性还需进一步的大样本、随机对照研究。

雌/孕激素达到怎样的比例才能更有利于胚胎种植？这一问题报道不一。有学者认为在新鲜移植周期中P/E2值在300～400间妊娠率较高[12]；也有研究认为，黄体早期，P值适当升高有利于妊娠，而P过高，E2下降，即较高比值的P/E2对妊娠不利[13]。王丽娜等[14]对自然周期冻融胚胎移植的研究发现，妊娠组移植后第3天P/E2显著低于未妊娠组；同样是FET周期，宋瑞芳等[15]却发现，临床妊娠组与活产组P/E2比值分别高于非妊娠组和未活产组。本研究中，自然周期与激素替代周期中，妊娠组与未妊娠组P/E2并无显著差异。因此，还需进一步的大样本研究来确定适宜胚胎种植的P/E2。

总之，移植后第3天雌激素水平可能预测自然周期冻胚移植的结局，但在激素替代周期中监测意义不大。