HCG在小鼠卵母细胞体外受精胚胎发育过程中的作用

邢雅欣，解其贵，杨志勇，刘玉兵，王玲，千日成*

(1.南通大学医学院，南通 226000；2.上海市第十人民医院生殖医学中心，上海 200072)

在过去的十几年中，胚胎培养体系得到了很大的改善，但它还是没有完全模拟体内的环境条件，由此体外培养形成的胚胎质量还是不如体内形成的胚胎质量。然而体外条件下，种植前的胚胎会分泌一些因子来对抗不利的培养条件，因此很多研究在胚胎培养液中添加一些胚胎分泌的因子以改善培养条件，以提高体外培养胚胎质量[1]。

HCG是胚胎最早分泌的分子信号之一[2-3]，受精后第2天即可检测到HCG mRNA的表达以及分泌[4]。并且植入前胚胎分泌HCG的量与胚胎质量相关[5]。HCG和黄体生成素(LH)结构功能相近，同属糖蛋白超家族，与相同的受体(LHCGR)结合引起下游反应。LHCGR是一种膜受体，属于G蛋白偶联受体超家族。Dinopoulou等[6]研究发现LHCGR表达于小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)的各个阶段以及体外受精之后合子、胚胎早期发育的各个时期。研究还发现除了在IVM培养液中添加HCG可以促进卵母细胞体外成熟之外，在受精和胚胎发育培养液中添加HCG对卵母细胞体外受精和胚胎发育有益。但是该研究未进行更深一步的分子生物学验证，也未观察HCG对常规体内成熟卵母细胞的体外受精及胚胎发育是否有影响。

本研究以小鼠体内成熟卵母细胞为研究对象，通过在体外受精及胚胎培养液中加入与Dinopoulou研究中相同浓度的HCG(1 500 U/L)进行体外受精和胚胎培养后，对其受精率、卵裂率和囊胚形成率以及囊胚内细胞团(ICM)、滋养层(TE)以及囊胚细胞总数，囊胚质量相关基因[基因多能性八聚体结合蛋白4(Oct4)、分化相关基因尾端型同源盒2(Cdx2)、氧化应激相关基因锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、侵袭相关基因基质金属蛋白酶9(Mmp9)]的表达情况进行了比较，为探讨HCG在受精及胚胎发育过程中的作用，为进一步研究胚胎发育机制、优化胚胎体外培养体系提供理论和实验依据。

材料和方法

一、材料

1.实验动物：雌性4～6周、雄性8～10周ICR小鼠，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。在稳定、标准化的实验动物环境中饲养：温度20～26℃，湿度40%～70%，光照/黑夜12/12 h，自由进食饮水。动物实验通过上海市第十人民医院实验动物伦理委员会批准。

2.试剂和仪器：孕马血清促性腺激素(PMSG，赤峰博恩药业)，HCG(珠海丽珠)，受精液(HTF)、胚胎培养液(KSOM)、精子获能液(TYH)(南京爱贝生物)，胎牛血清(FBS)、M2操作液、矿物油(Sigma，美国)，35 mm胚胎培养皿(Corning，美国)，微量RNA抽提试剂盒、微量反转录试剂盒、Real time RT-PCR试剂盒(QIAGEN，美国)，小鼠Cdx2抗体(Biogenex，美国)，Alexa Fluor 488标记的兔抗小鼠二抗(Invitrogen，美国)，DAPI染色液(上海碧云天)，7900荧光定量PCR仪(ABI，Prism，美国)，C2激光共聚焦显微镜(Nikon，日本)。

二、研究方法

1.实验分组：依据培养液中HCG浓度分为对照组和HCG组，对照组的受精液HTF和胚胎培养液KSOM中HCG浓度为0 U/L，HCG组的受精液HTF和胚胎培养液KSOM中HCG浓度为1 500 U/L。配制的培养液需在培养箱(37℃、6% CO2、5%O2)中平衡过夜。

2.小鼠IVF：4～6周龄ICR雌性小鼠，每只腹腔注射10 U PMSG，48 h后注射10 U HCG，16～18 h后颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，无菌条件下取出双侧输卵管于M2操作液中，体视显微镜下用1 ml无菌注射器针头划破输卵管膨大处，使卵冠丘复合物(COCs)完全释放出来，立即转入HTF受精液中，加入提前在TYH获能液中孵育1 h的精子。受精6 h后用HTF液洗涤受精卵，记录受精情况，将形态正常的受精卵在KSOM液中继续培养，在24 h和96 h观察并计算2-细胞、囊胚的发育情况。

3.RT-qPCR检测囊胚中相关基因的表达：采用RT-qPCR检测HCG组和对照组囊胚相关基因mRNA表达水平，以GAPDH作为内参。各基因引物序列如表1所示。将HCG组、对照组囊胚吸出，PBS中洗涤后按照微量RNA提取试剂盒说明书提取各组总RNA后，立即用微量反转录试剂盒反转录成cDNA，用于RT-qPCR，体系如下：QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix(2×)10 μl、QN ROX Reference Dye 2 μl、Primer Forward(10 μmol/L)1.4 μl、Primer Reverse(10 μmol/L)1.4 μl、cDNA 2 μl，余下用ddH2O补齐至20 μl。反应条件：两步法PCR扩增标准程序：预变性95℃ 2 min，PCR反应95℃ 5 s、60℃ 30 s，共40个循环。待反应结束后确认扩增曲线和融解曲线。将目的基因与内参的所得结果相比，所得的比值为目的基因的相对表达量，结果以2-△△Ct表示。每20枚囊胚为一份样本，每组各收集3份，共6份样本。

4.囊胚免疫荧光标记：(1)在室温条件下，将囊胚用1% BSA-PBS洗3次，每次10 min，然后移入4%多聚甲醛液中固定30 min；(2)固定完成后1% BSA-PBS中洗2次；(3)将固定后的囊胚移入含有 0.15%～0.25% Triton X100的1% BSA-PBS室温1 h，1% BSA-PBS中洗涤2次；(4)将囊胚移入小鼠Cdx2抗体稀释液中(稀释比为1∶100)，4℃过夜，1% BSA-PBS中洗涤2次；(5)将囊胚移入Alexa Fluor 488标记的二抗稀释液(稀释比为1∶500)，室温遮光1 h，1% BSA-PBS中洗涤2次；(6)将囊胚移入DAPI染色液滴中，室温遮光孵育5 min，1% BSA-PBS中清洗；(7)在玻璃底的培养皿内做若干 1% BSA-PBS 的液滴，并用矿物油覆盖，将染色完成的胚胎移入皿中，激光共聚焦显微镜下进行观察计数并拍照。观察囊胚ICM、TE数以及囊胚细胞总数。

5.观察指标：受精率=双原核1-细胞数/成熟卵母细胞数×100%，2-细胞率=2-细胞总数/1-细胞总数×100%，囊胚形成率=囊胚数/1-细胞总数×100%。

三、统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。目的基因mRNA表达以(±s)表示，采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有极显著统计学意义。

结 果

一、对照组和HCG组胚胎体外发育情况

对照组和HCG组小鼠卵母细胞体外受精6 h后去除周围的颗粒细胞及精子，观察双原核细胞数量，24 h、96 h观察胚胎发育情况，并计算受精率、2-细胞率、囊胚形成率。结果显示，HCG组的受精率、2-细胞率以及囊胚形成率与对照组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 小鼠胚胎体外发育情况[n(%)]

二、两组囊胚质量相关基因mRNA的表达相对水平比较

HCG组相关基因Cdx2、MnSODmRNA的表达水平显著高于对照组(P<0.05)；与对照组相比，HCG组Mmp9基因mRNA的表达水平上调，具有极显著性差异(P<0.01)；两组的Oct4基因mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)(图1)。

两组相比较，*P<0.05，**P<0.01图1 对照组和HCG组相关基因mRNA的表达

三、囊胚计数

采用免疫荧光法，对两组囊胚进行Cdx2蛋白标记，以及DAPI染色。抗Cdx2蛋白抗体将囊胚TE标记为绿色，DAPI将囊胚细胞核染成蓝色(图2)，ICM细胞数为两者差值。结果显示HCG组囊胚细胞总数显著高于对照组(P<0.05)，HCG组ICM细胞数及TE 细胞数多于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。两组ICM/TE值相比较，差异也无统计学意义(P>0.05)(表3)。

Cdx2标记的外滋养层细胞(绿色)；DAPI标记的细胞总数(蓝色)；Merge为两种标记的合图图2 小鼠囊胚差异性染色结果(免疫荧光染色，×200)

组 别囊胚细胞总数 ICM细胞数TE细胞数ICM/TE值对照组52.3±9.113.2±3.939.1±7.80.3HCG组61.7±16.3*15.4±3.846.2±13.10.3

注：与对照组比较，*P<0.05

讨 论

HCG作用广泛，被称为当今科学界的奇迹[7]。HCG 作为糖蛋白激素家族中的一员，同 LH 都是通过 LH/HCG 受体发挥生物学作用[8-9]。LHCGR是一种跨膜G蛋白偶联受体，主要通过 cAMP-磷脂酶 C/三磷酸肌醇途径介导的信号通路发挥其生物学功能[10]。HCG 和卵巢细胞膜上的 LHCGR 相结合，激活腺氨酸环化酶系统刺激甾体激素的合成，进而介导受精卵着床、性腺发育及功能活动的调节等哺乳动物的生殖过程中：取卵前用HCG扳机提高卵母细胞成熟率、卵母细胞体外发育潜能及临床妊娠率[11]；HCG促进哺乳动物卵母细胞体外成熟、受精及早期胚胎发育[12-13]；胚胎植入过程中，HCG是母胎界面分子交流最重要的信号分子[14]，胚胎滋养层分泌的HCG以自分泌的形式刺激其侵入子宫内膜[15]，改善子宫内膜容受性(ER)、延长种植窗口期，有利于胚胎着床，还可以调节子宫内膜的免疫耐受性；怀孕期间HCG通过卵巢黄体细胞合成孕激素，阻止月经来潮，维持妊娠等。

胚胎体外发育过程中，最早在2-细胞期即可检测到HCG分泌；从卵母细胞到合子、各细胞期胚胎均有HCG mRNA及其受体的表达。之前很多研究分析了胚胎分泌的HCG对子宫内膜的作用，但很少研究胚胎分泌的HCG对胚胎本身的作用。而且，仅仅依靠形态学来评价胚胎质量是不够的。本研究采用双重染色方法分别计数ICM和TE，结果表明，胚胎培养液中加入HCG，虽然对小鼠囊胚ICM、TE细胞数增多作用并不明显，但是小鼠囊胚细胞总数整体水平显著提高，提示了HCG对改善小鼠囊胚质量的重要作用。

本研究不仅从形态学及囊胚细胞计数方面观察到HCG对改善囊胚质量的作用，而且发现胚胎培养液中添加HCG刺激体外形成的小鼠胚胎发育质量相关的基因mRNA[16-19]的表达发生变化。

相关基因Cdx2蛋白是一个重要的转录因子，在哺乳动物囊胚中仅存在于外滋养层细胞。胚胎Cdx2基因在8细胞期开始表达，并逐渐开始在外滋养层表达上调，是外滋养层特异性表达因子[20]，也是胚胎分化的重要相关基因[21]。本研究中，在胚胎培养液中加入HCG后，Cdx2基因表达明显上调，可能预示着HCG促进体外囊胚细胞分化良好。Oct4特异性表达于ICM，与种植前胚胎发育和多能性相关[22]。本研究结果表明，HCG组Oct4基因表达上调不明显，可能与胚胎体外发育过程中ICM增殖速度没有TE快，与囊胚差异性染色结果相符[23]。通常认为胚胎培养过程中细胞内产生过度的活性氧对胚胎不利。氧化应激被认为是胚胎发育不良的原因之一。MnSOD存在于哺乳动物线粒体中，是体内重要的氧自由基清除剂[24]。Rizos等[25-26]研究发现，体内发育形成的胚胎MnSODmRNA表达水平比体外条件下更高。本研究中，HCG组MnSODmRNA表达水平比对照组显著增高，说明在培养液中加入HCG使胚胎培养体系更接近体内环境。胚胎成功植入子宫内膜是辅助生殖技术中最重要的环节之一[27]，基质金属蛋白酶9(MMP9)被认为是着床过程中水解细胞外基质最重要的蛋白水解酶[28]，在哺乳动物生殖过程中与胚胎迁移、侵袭和组织重建相关[29-30]。研究显示胚胎分泌的MMP9的量与胚胎质量成正比。而胚胎分泌的HCG可以促进胚胎和子宫内膜MMP9的分泌[31-32]。本研究结果也显示在胚胎培养液中添加HCG后Mmp9 mRNA表达量极显著增加，有利于胚胎的植入。

综上所述，在受精培养液中添加HCG对小鼠卵母细胞体外受精情况没有影响，但是在胚胎培养液中添加HCG增加囊胚细胞总数，使胚胎质量相关基因表达上调，有潜力成为改善胚胎体外培养质量、优化胚胎体外培养体系的重要因子。至于HCG在此过程中的具体机制还有待进一步研究。