解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌的抑制作用

李 扬，张朝红，于秋香，李 杰，张献辉

（1.河北省农林科学院昌黎果树研究所，河北 昌黎 066600；2.新疆农垦科学院林园研究所，新疆 石河子 832000）

枣黑斑病最早于1985年发现[1]，1996年在山西枣区暴发流行[2]，近年来在新疆、云南、山东、河北和河南等地普遍发生[3，4]，给当地枣农及枣产业发展造成了重大损失。目前，枣黑斑病的防治以喷施化学药剂为主，而连年施用化学农药易产生抗药性、发生药物残留等问题[3，5]。

减少或避免使用化学农药，减轻环境污染，保障食品安全和发展有机农业是我国现代农业发展的重要方向[5，6]。生物防治是通过植物、病原物、生防菌、植物表面及其周围微生物群落和自然环境等因素的相互作用，达到防治病害的目的。自1914年开始，生物防治受到关注，现已成为植保研究的热点之一。采用拮抗微生物来防治植物病害是植物病害防控的一个重要手段[7]。以前期筛选的拮抗菌——解淀粉芽孢杆菌ZJ01为试材，研究其对枣黑斑病菌的抑制效果，以期为枣黑斑病的生物防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：解淀粉芽孢杆菌ZJ01（序列号HQ910433），由河北农业大学中国枣研究中心提供，从健康枣叶片中分离获得[8]；枣黑斑病菌LG（LG），由塔里木大学植物科学学院提供。

PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂14 g、葡萄糖20 g和蒸馏水1 L。NB培养液：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L和蒸馏水1 L。培养基和培养液的配制参照方中达的《植病研究方法》[9]，制作完成后在蒸汽高温灭菌锅内121℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌菌落生长的抑制作用 将LG于25℃条件下在PDA培养基上培养，3～6 d后在菌落边缘打取直径6 mm的菌饼，接种于已灭菌的PDA培养基中心（培养皿直径10 cm）。将解淀粉芽孢杆菌ZJ01于25℃条件下在PDA培养基上划线培养，2～3 d后在菌落中央打取直径6 mm的菌饼，接种于LG两侧2 cm处；以未接种解淀粉芽孢杆菌ZJ01的LG培养基作为对照。5次重复。于25℃条件下培养8 d后，测量菌落半径以及趋向半径，计算被抑制率〔%，（对照菌落半径-处理菌落半径）/对照菌落半径×100%〕。同时，挑取对照和对峙区域带菌落的培养基，在显微镜下观察LG菌落菌丝的形态变化。

1.2.2 解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌孢子萌发的抑制作用 将LG于25℃条件下在PDA培养基上培养7 d后，加入5 mL无菌水冲洗，用移液枪吸取冲洗液后用事先已经灭菌的纱布过滤得到LG孢子悬浮液，浓度达1×107个/mL。

将解淀粉芽孢杆菌ZJ01接种于NB培养液中，于28℃摇床上振荡培养48 h，获得解淀粉芽孢杆菌ZJ01发酵液。将解淀粉芽孢杆菌ZJ01发酵液在4℃、10 000 r/min条件下离心15 min，取其上清液，经细菌过滤器抽滤后得到含有解淀粉芽孢杆菌ZJ01代谢产物的无菌发酵原液；然后，分别稀释0倍、2倍、4倍和8倍，得到4种不同浓度的无菌发酵液。

吸取NB无菌培养液（CK）和4种不同浓度的解淀粉芽孢杆菌ZJ01无菌发酵液各40 μL，分别滴入载玻片的凹槽中，晾干后再分别滴入40 μL的LG孢子悬浮液，3次重复。于25℃条件下保湿培养24 h后，在显微镜下观察孢子的萌发情况[10]。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌LG菌落生长的抑制作用

2.1.1 对菌落生长的抑制 解淀粉芽孢杆菌ZJ01与枣黑斑病菌LG平板对峙培养4 d时，LG菌落出现抑制区域；培养至8 d时，抑制区域较为明显，LG的被抑制率达到53.3%（图1）。

图1 解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌LG菌落生长的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the colony of A.alternata LG

2.1.2 对菌丝生长的抑制 培养8 d后，对照培养的枣黑斑病菌LG菌丝依然平滑，没有出现异常变化（图2-A、2-B）；对峙区的枣黑斑病菌LG菌丝生长受到明显抑制，表现为菌丝顶端膨大（图2-C、2-D）、异常产孢（图2-D、2-E），原生质发生割裂（图2-F）等。

图2 解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌LG菌丝形态的影响Fig.2 Effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the shape of A.alternata LG mycelium

2.2 解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌LG孢子萌发的抑制作用

通过显微镜观察凹面载玻片上枣黑斑病菌LG孢子的萌发情况发现，解淀粉芽孢杆菌ZJ01的代谢物对枣黑斑病菌LG孢子萌发具有明显的抑制作用（图3）。其中，CK处理的枣黑斑病菌LG孢子萌发产生了大量的网状菌丝（图3-A）；而解淀粉芽孢杆菌ZJ01无菌发酵液处理的枣黑斑病菌LG孢子仍清晰可见，且多数孢子上产生了圆形小泡，仅有少量孢子产生了萌发管，且萌发管长度与孢子大小相当（图3-B~E）。说明解淀粉芽孢杆菌ZJ01的代谢物抑制了枣黑斑病菌LG的孢子萌发及菌丝生长。

图3 解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌LG孢子萌发的影响Fig.3 Effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the spores germination of A.alternata LG

3 结论与讨论

芽孢杆菌对病原菌形态产生的影响包括菌丝破裂[11]、坏死、液泡状膨大、过度膨大等[12]。本研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌ZJ01会诱导枣黑斑病菌LG菌丝过度膨大、产生割裂形态和异常产孢。从形态上明确了解淀粉芽孢杆菌ZJ01对枣黑斑病菌的抑制作用。对于异常产孢后，其孢子的生活力如何、能否正常萌发还有待进一步研究。

自然条件下枣黑斑病以链格孢菌孢子的形式侵染，因此，解淀粉芽孢杆菌ZJ01抑制枣黑斑病菌孢子萌发就成为防控枣黑斑病的关键之一。通过对解淀粉芽孢杆菌ZJ01无菌发酵液与枣黑斑病菌LG进行玻片对峙培养发现，解淀粉芽孢杆菌ZJ01的代谢产物能明显抑制枣黑斑病菌LG孢子的萌发。今后，对于解淀粉芽孢杆菌无菌发酵液抑菌的最佳使用浓度还有待进一步研究。