白桦黄叶突变株叶色变化规律及苗高生长特性分析

任烁淇 刘冰洋 李雪莹 邢建辉 李政纶 王 楚 冮慧欣 刘桂丰 姜 静

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)是我国重要工业用材树种和山地造林树种，自20世纪90年代白桦被列为科技攻关树种以来，作者所在研究团队先后开展了杂交育种、强化育种、倍性育种等研究[1～5]，尤其在基因工程育种方面取得了一定的成效，自2003年以来相继进行了白桦耐盐、缩短童期、改变木质素含量等转基因研究[6～9]，迄今为止，获得了130余个独立转化株系，其中在获得的18个BpCCR1过表达转基因白桦中，发现了一株转基因白桦叶片颜色明显不同其他转BpCCR1白桦，该转基因株系除了叶色黄化性状与其他转基因株系有差异外(包括非转基因野生型白桦)，其它表型性状均无差异，我们认为该株系是由于T-DNA插入(含外源基因)而产生的突变体[9]。

叶色突变是植物中最常见的突变性状，迄今为止已在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、小麦(Triticumaestivum)、棉花(AnemonevitifoliaBuch)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等多种植物中发现了不同类型的叶色突变体[10～16]。叶色变异不仅可以作为标记性状应用于水稻等作物的杂交制种，在基础研究中，叶色突变体是研究植物光合作用机制、叶绿素生物合成分解途径、遗传表达机理、质—核基因互作以及信号传导途径等一系列生理代谢过程的理想材料[17～21]，因此，叶色突变体备受育种工作者的关注。实验以黄叶突变株为试验材料，测定叶绿素与叶色的时序变化规律，分析其生长特性，研究结果为后续开展突变基因的功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

3年生的转BpCCR1基因白桦黄叶突变体(yl)、转基因株系(CR11)及非转基因野生型白桦(WT)，每个株系30株，种植于30 cm×20 cm花盆中，置于白桦育种基地进行常规管理。

1.2 方法

1.2.1 叶片颜色的时序变化

(1)RHS比色：将叶片近轴面与RHS标准比色卡(英国皇家园艺学会)进行对比，记录叶片的颜色。

(2)色差仪比色：采用分光色差仪(KONICA MINOLTA CR-400)测定参试株系叶片的中部，每个株系测定30个不同单株，每株1个叶片，取其平均值。测定于5月1日开始，9月11日结束，每10 d测定1次。测量结果用CIELab表色系统进行色度分析，其中，L*代表黑色到白的间的位置，既明亮度(Lumination)，范围是0～100；a*代表红(+a)绿(-a)色轴饱和度；b*代表黄(+b)蓝(-b)色轴饱和度(图1)。

图1 CIELab表色系统色品图Fig.1 Chromaticity diagram of CIELab color numeration system

1.2.2 叶片叶绿素含量的测定

采用便携式叶绿素测定仪(SPAD-502 PLUS，KONICA MINOLTA)测定yl、CR11及WT株系功能叶的叶绿素相对含量，读取SPAD值，测定于5月1日开始，9月11日结束，每10 d测定1次，每次每个株系测定10株树叶片，3次重复，共计测定30个株系，每株树均测定健康的第4叶片。

1.2.3 生长性状调查

于5月3日开始，10月1日结束，每10 d调查1次，共调查14次(以1月1日为第1天，5月3日为第123天，以此类推，最后调查的时间10月1日为第273天)。用米尺测量参试株系苗高，待苗木停止生长后，用游标卡尺测量地径，yl、CR11及WT株系分别调查30株。

1.2.4 数据处理

数据利用MATLAB Compiler Runtime 8.3对苗高的生长规律进行Logistic方程拟合，Logistic曲线方程：

(1)

式中：y为苗木苗高(cm)；t为苗木生长的时间，1月1日为1 d；a为苗木开始生长时的苗高初始值(cm)；b为苗木停止生长时苗高值(cm)；t0为苗木苗高日生长速度最快的日期(d)；c为曲线在苗木苗高日生长速度最快处的斜率(cm·d-1)。

苗木苗高年生长阶段的划分可通过对式(1)求三阶导数，结果为：

(2)

用t1和t2表示速生期的开始期和速生期结束期，利用t1和t2将苗高的年生长过程分为三个阶段：(0，t1)、(t1，t2)、(t2，封顶)。第一阶段为“前慢期”，处于该阶段的苗木生长逐渐加快；第二阶段为“速生期”，处于该阶段的苗木持续快速生长；第三阶段为“后慢期”，处于该阶段的苗木生长逐渐减慢，直至封顶。在符合“S”型曲线的林木个体生长过程中，速生期是林木生长的关键阶段[22～23]，通过拟合方程得出几个速生期参数。

(1)速生期的起始点t1；

(2)速生期的结束点t2；

(3)速生点t0；

(4)速生期的持续时间RR=t2-t1；

(5)速生期苗高的平均生长量GR=t2点的苗高-t1点的苗高；

(6)速生期内苗高日生长量的平均值GD=GR·RR-1；

(7)速生期内生长量占总生长量的比值RRA=GR·(b-a)-1。

2 结果与分析

2.1 黄叶突变株叶色时序变化规律

RHS比色卡测定结果显示，yl突变株的叶色一直呈现深黄绿色，CR11(转基因对照)株系的叶色在6月初为深黄绿色，随后渐渐的变为浅橄榄绿或暗橄榄绿，而WT(野生型)株系从6月上旬开始叶色由原来的浅橄榄绿渐渐的变为暗橄榄绿。总之，参试株系的生长发育阶段，yl的叶色主要呈现深黄绿色，而两个对照株系的叶色是以橄榄绿色为主(图2)。

色度计测定结果显示，在生长季的不同发育时期，参试株系叶片的a*值均小于0，而b*值均大于0，叶片颜色均分布于表色系统色品图的第二象限黄绿色区域(图1),黄叶突变株的L*值为48.17～56.77；a*值为-20.04～-15.02；b*值为23.1～44.3，而对照株系的L*值为29.65～43.89；a*值为-15.97～-6.64，b*值为7.06～23.68(图3)，进一步分析发现，黄叶突变株的L*值和b*值均显著高于2个对照株系，a*值显著低于2个对照株系(P≤0.05)。表明黄叶突变株的叶色在不同发育时期其亮度及黄色程度均高于2个对照株系，从黄叶突变株叶色参数b*值也可以看出其叶色更趋向于CIELab系统色拼图的黄色区域。

图2 不同发育期参试株系叶片颜色观察 a～c.6月5日的叶色；d～f.7月5日的叶色；g～i.8月5日的叶色；j～l.9月5日的叶色 a.WT(146 Moderate Olive Green A)；b.CR11转基因株系(144 Strong Yellow Green A)；c.黄叶突变株(N144 Strong Yellow Green A)；d.WT(NN137 Greyish Olive Green D)；e.CR11(137 Moderate Olive Green B)；f.黄叶突变株(144 Strong Yellow Green A)；g.WT(NN137 Greyish Olive Green A)；h.CR11(139 Dark Yellowish Green A)；i.黄叶突变株(144 Strong Yellow Green A)；j.WT(NN137 Greyish Olive Green A)；k.CR11(139 Dark Yellowish Green A)；l.黄叶突变株(144 Strong Yellow Green A)Fig.2 Leaf color observation in different development periods of the test lines a-c. The leaf color on June 5；d-f. The leaf color on July 5；g-i. The leaf color on August 5；j-l. The leaf color on September 5

2.2 黄叶突变株叶绿素含量的时序变化

由图4可见，从早春到9月中旬，2个对照株系各发育时期其叶绿素SPAD值均显著高于黄叶突变株(P<0.05)，2个对照株系SPAD均值为39.15，而yl突变株系的SPAD值为18.84，仅是2个对照株系的48.12%。

图3 参试株系叶片L*值、b*值、a*值时序变化 a、b、c为同一时间点3个参试株系L*值、b*值、a*值的多重比较Fig.3 Temporary variation of test lines about value a,value b and value L a,b and c in figures indicate the multiple comparisons between test lines about value a,value b and value L in the same time

图4 参试株系叶绿素含量相对含量时序变化 a、b、c为同一时间点3个参试株系SPAD值的多重比较Fig.4 Temporary variation of the test lines about relative chlorophyll content a,b and c in figures indicate the multiple comparisons between test lines about SPAD value in the same time

2.3 黄叶突变株生长特性分析

2.3.1 参试株系苗高生长模型的建立与拟合

分别对参试株系苗高生长过程进行拟合(图5)，3个株系苗高生长过程为“S”型曲线，用4参数Logistic方程式(1)对3个株系共90个单株苗高进行拟合取平均值，方程中各参数见表1，各生长模型方程的拟合系数均高于0.95，达到显著水平，说明用4参数Logistic曲线方程对参试株系生长节律进行拟合是准确可靠的，可用于参试株系高生长分析与预测。

由表1可知，yl突变株与2个对照株系的苗高生长(即停止生长后的实测值)差异显著(P<0.05)，yl苗高显著低于2个对照株系，yl苗高均值仅为2个对照株系均值的35.15%，其苗高速生点处的生长速度为0.755 cm·d-1，显著低于2个对照株系，仅为2个对照均值的50.9%。

2.3.2 黄叶突变株速生期生长参数变异

参试株系苗高从5月初开始生长，9月中下旬封顶，生长期约为140 d。由表2可知，yl突变株与2个对照株系从开始生长、到进入速生期以及速生期结束的时间基本一致，不同的是yl在速生期内苗高的平均生长量(GR)为38.61 cm，显著低于2个对照株系，其速生期内苗高日生长量均值(GD)也显著低于2个对照株系，仅为2个株系均值的58.50%，yl与2个对照株系的速生期内生长量占总生长量的比值RRA无明显差异。

3 讨论

植物随季节的变化往往叶片颜色也伴随着的变化，特别是春秋两个季节叶色的变化更明显。野生型白桦叶片春季开始萌叶，即叶片在生长初期，其叶绿素含量较少，其叶绿素SPAD值仅为32.41，到了8月以后，SPAD值达到48.61，即由浅橄榄绿逐渐变为暗橄榄绿，只有在落叶前叶片呈现黄色。而黄叶突变株叶片颜色明显不同野生型白桦，在其生长发育期内叶绿素SPAD值一直显著低野生型白桦，从早春到深秋叶片始终为深黄绿色。植物叶色变异也往往与叶绿体中色素含量的变化有关[22～24]。在多数黄化突变体中,其叶绿素的含量显著低于野生型[25～26]，白桦黄叶突变株与前人研究结果类似，即叶色在各发育时期其叶绿素SPAD值均显著低于对照株系(P<0.05)，yl突变株系的SPAD值为18.84，仅为2个对照株系的48.12%。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，其含量多少不仅影响叶片颜色，同时也影响植物生长与产量等[27]。对水稻低叶绿素含量突变体研究发现，该突变体虽然叶绿素含量降低，但叶绿体的发育并未受到影响，高光强下其并未受到光抑制，光反应电子传递也未受影响。产量数据表明，黄叶突变体的产量与对照无显著差别[27]。而本实验的黄叶桦突变株则与前人研究结果不同，叶绿素SPAD值较对照株系显著降低，其苗高生长也显著低于2个对照株系，即速生期内苗高均值仅是2个对照株系均值的69%。推测yl突变体苗高生长低于对照株系可能是叶绿体发育异常，以及叶绿素含量的降低所致。人们在对白榆(Ulmuspumila)的天然黄叶突变体中华金叶榆的研究中也发现，其苗高生长缓慢，叶绿素含量及净光合速率显著低于绿叶白榆[28]。

叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，诸多研究表明由叶绿素合成缺陷而产生的突变体，其叶绿体内部结构也将发生一定的变化[29]，叶绿素的合成是一个由许多酶参与的复杂过程，从谷氨酰-tRNA(Glu-tRNA)开始到叶绿素b的合成结束为止一共包括16步，涉及20多个基因编码的16种酶参与完成，该途径中任何一个环节发生突变都可能影响叶绿素的合成，从而引起叶色变异[30]。因此，叶色突变的分子机制较为复杂，引起叶色突变的基因种类也繁多，yl突变体是研究团队获得的白桦T-DNA插入突变体，目前突变基因的克隆正在进行中，一旦获得引起突变性状的基因并验证其功能，将可解释yl突变体类囊体发育异常和叶绿素合成缺陷等现象，也将为园林绿化彩叶树基因工程育种提供基因资源。

图5 参试株系树高逻辑斯蒂拟合曲线Fig.5 Logistic fitting curve of the test lines about height

株系Lines封顶后苗高实测值Measure values of height when test lines stop growing(cm)R2苗木开始生长时苗高值aValues of height when test lines start growing(cm)苗木停止生长时苗高值bValues of height when test lines stop growing(cm)速生点t0Fast-growing point(d)苗高速生点处生长速度The growing speed on fast-growing point(cm·d-1)WT(对照1)Control group 1244.7(a)0.9898155.4375(a)244.7(a)190(a)1.484(a)CR11(对照2)Control group 2207.1(b)0.9884120.6(b)207.1(b)200(b)1.481(a)yl146.5(c)0.959997.2(c)146.5(c)194(ab)0.755(b)

表2 参试株系速生期生长参数比较