高产糖化酶根霉菌株的筛选、鉴定及其在孝感米酒中的应用

南小华,李 牧,陈福生*

(华中农业大学 食品科技学院,湖北 武汉 430070)

米酒是以大米(籼米、粳米、糯米等)为原料经酒曲中的微生物酿造而成的,是我国传统的发酵酒精饮料,世界古代三大酒精饮料之一[1]。因其酒精含量较低,口味独特,口感醇厚,香气浓郁,酸甜适中且富含多种氨基酸、维生素以及葡萄糖、麦芽糖、低聚糖等,深受人们的喜爱[2]。糖化是米酒发酵的重要阶段,主要由酒曲中微生物分泌的淀粉酶将大米淀粉转化为单糖、麦芽糖、糊精等[3]。糖化力的高低直接影响米酒的出酒率,也会影响米酒的口感和风味[4]。根霉(Rhizopus spp.)作为糖化酶的产生菌种之一,目前国内外对根霉产糖化酶条件的优化较多[5-7],在米酒酿造方面也有研究[8-9],但对于孝感米酒的研究较少。

孝感米酒作为湖北地方特色小吃,以凤窝酒曲发酵酿制而成,是一种酒精度低、营养价值高的固体发酵饮料[10]。酒曲作为“酒之骨”,是决定米酒品质的关键[11]。传统凤窝酒曲是在特定的生态环境内,以成曲作为母种在开放体系中培养制得[12]。菌种除优势菌根霉外,还包括细菌、酵母菌等其他微生物。由于自然环境下制得的酒曲微生物种类丰富,群落结构复杂,且微生物类群容易随环境温度、湿度季节性变化而发生改变,使得酒曲质量不稳定,加上生产孝感米酒的多数企业仍是以手工作坊式的生产方式为主,生产工艺难以控制,导致米酒产品质量不稳定[13]。

为了提高孝感米酒酒曲的质量,保证米酒的品质,本研究以实验室从孝感米酒酒曲中分离的14株根霉菌株为材料,筛选1株高产糖化酶的优良根霉菌株,进行形态学和分子生物学鉴定。在此基础上,以其为菌种,按照孝感米酒的酿造工艺酿造孝感米酒,并对孝感米酒的理化指标、感官品质及挥发性成分进行分析,为米酒的酿造提供优良菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原材料

糯米和籼米:市售优质米。

1.1.2 菌株

根霉(Rhizopus spp.)菌株R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、070101、070102、070103、070104、070105、Q1、S2:实验室从孝感米酒酒曲中分离所得[3]。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,PDA)培养基:200 g土豆去皮后切成小块,加水煮沸至玻璃棒正好能将土豆戳破后,过滤,加入20 g葡萄糖,15 g琼脂粉,蒸馏水定容至1 000 mL,pH自然。

马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)培养基:PDA培养基中不加琼脂。

普氏液(Pfeffer)培养基:NH4NO310 g,KH2PO45 g,MgSO4·7H2O0.25g,FeCl30.01g,蔗糖50g,蒸馏水1000mL,调节pH至4.5。

糯米饭培养基:称取100g糯米于饭盒中,加水浸泡12h后,沥干。

米粉培养基:籼米磨碎,过60目筛,分装于250 mL三角瓶,20 g/瓶。

除米饭培养基于105℃灭菌30 min外,其他培养基于121℃条件下灭菌20 min。

1.1.4 主要试剂

葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、NaOH、可溶性淀粉、NaHCO3、KH2PO4、乙酸、乙酸钠等(均为分析纯)、环己酮(纯度≥99%):国药集团化学试剂有限公司;18SrDNA通用引物、胶回收试剂盒:上海生物工程公司合成;Easy Taq脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)polymerase(5 U/μL)、三磷酸脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs)、DL 2000 Plus DNA marker:北京全式金生物技术有限公司;γ-氨基丁酸标准品(纯度≥99%)、2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)(纯度≥99%):阿拉丁公司。

1.2 仪器与设备

T960聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)仪:杭州博日科技有限公司;WD-9413B凝胶成像分析仪、DYY-8C电泳仪:北京六一生物科技有限公司;722N紫外可见分光光度计:上海仪电分析仪器有限公司;TQ8040气相色谱质谱(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)联用仪:日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 高产糖化酶根霉菌株的筛选

将30 mL无菌水加入无菌糯米饭培养基中,用无菌筷子将糯米饭打散,分别接种2 mL根霉R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、070101、070102、070103、070104、070105、Q1、S2的孢子悬液(1×106CFU/mL),混匀后,于30℃培养3 d,分别测定糖化酶活力、还原糖含量、总酸度,并对其进行感官评价,筛选获得高产糖化酶的菌株。

1.3.2 根霉Q1的鉴定

(1)形态学鉴定[14-15]

菌株的活化:用接种环接种少量根霉Q1菌丝于PDA试管斜面,于28℃培养3 d。

菌落形态观察:将活化好的根霉Q1点接于PDA培养皿上,于28℃培养箱中进行培养,培养2～3d,观察其菌落形态。

显微形态观察:采用插片法[16]对根霉Q1显微形态进行观察。

根霉Q1在不同温度条件下的生长情况:分别接种2%(V/V)根霉Q1孢子悬液(1×106CFU/mL)于普氏培养液和PDB培养基中,分别将其置于30℃、37℃、45℃条件下、170 r/min的摇床中进行培养,观察其生长情况。

(2)分子生物学鉴定

采用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)法提取根霉Q1的基因组DNA,以其基因组DNA为模板,利用真菌18SrDNA通用引物进行PCR扩增[17]。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并用胶回收试剂盒对其PCR扩增产物纯化,纯化后送至上海生工完成测序。将测序结果在美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnologyinformation,NCBI)中进行Blast同源性比对分析,选取相似度为97%以上的不同根霉种序列,利用Mega7.0进行多序列比对,根据邻近法(neighborjoining,NJ)构建系统进化树。

1.3.3 孝感米酒的制作工艺及操作要点

孝感米酒制作的工艺流程[18]:

操作要点:

(1)洗米、浸米:挑选优质糯米,用自来水清洗干净,室温浸泡8～10 h。

(2)蒸饭:将糯米取出用纱布沥干水后置于高压蒸汽灭菌锅中121℃蒸米20 min。

(3)淋饭:蒸煮好的糯米取出立刻用凉开水冲洗使糯米迅速降温冷却。

(4)制曲:向无菌米粉培养基中加入6 mL无菌水,接种0.4 mL(2%,V/W)根霉Q1孢子悬液(1×106CFU/mL),于28℃培养4 d,取出置于40℃烘箱中烘干,粉碎保存。

(5)拌曲:将冲凉的糯米饭转入玻璃泡菜坛中,按1%(W/W)接种量拌入纯种米根霉Q1酒曲,用无菌筷子混匀。

(6)发酵:将接好曲的糯米饭放入30℃培养箱中培养发酵36 h。

对米酒中还原糖、总糖、酒精度、总酸度、挥发性风味成分、γ-氨基丁酸(gama-amino butyric acid,GABA)含量进行测定,并进行感官评价。

1.3.4 分析检测方法

糖化酶活力的测定:采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法测定,具体参照文献[19]。糖化酶酶活定义:1 g固体酶(或1 mL液体酶)在40℃、pH 4.6条件下,1 h内水解可溶性淀粉产生葡萄糖的毫克数,即为一个酶活力单位(U)。

还原糖含量的测定:采用DNS比色法进行测定,具体参照文献[20]。

总糖含量的测定:采用苯酚-浓硫酸比色法进行测定,具体参照文献[21]。

总酸度的测定:采用NaOH滴定法,具体参照国标GB/T 12456—2008《黄酒》[22]。

酒精度的测定:采用蒸馏-重铬酸钾比色法进行测定,具体参照文献[23]。

GABA含量的测定:采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法进行测定,具体参照文献[24]。

挥发性风味成分的分析:以环己酮作为内标,采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase micro-extraction,HSSPME)和气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)对根霉Q1酿造的孝感米酒中挥发性风味成分进行定性定量分析,具体参照文献[25-26]。

感官评定:从气味、口感、色泽和组织形态方面对根霉菌株发酵的糯米饭进行感官评分,由10位具有一定专业水平的人员组成评定小组进行客观评分,满分100分,感官评价标准见表1。

表1 米酒的感官评分标准Table1 Sensory evaluation standards of rice wine

2 结果与分析

2.1 高产糖化酶根霉的筛选

14株根霉菌在米饭培养基中发酵3 d后,测定糯米饭中的糖化酶酶活、还原糖含量和总酸度(以乳酸计),并进行感官评分测定,结果如图1所不。

图1 不同根霉菌株在糯米饭中的糖化酶酶活(A)、还原糖含量(B)、总酸含量(C)以及感官评分(D)测定结果Fig.1 Determination results of glucoamylase activity(A),reducing sugar content(B),total acid content(C)and sensory evaluation of different Rhizopus strains in glutinous rice

由图1A可知,根霉Q1的糖化酶活力最高,为202.55U/g,其他13株根霉均＜100.00 U/g。图1B可知,根霉Q1的还原糖含量最高,为257.78 mg/g,其余均＜150 mg/g,与糖化酶活力基本对应。由图1C可知,根霉Q1、S2、070104发酵糯米饭的总酸度相对较低,分别为5.17 mg/g、3.52 mg/g、1.60mg/g。由图1D结合表1的感官评分标准可知,根霉Q1酿造的米酒甜酸适中,感官评分最高,为81分,而其他根霉菌株酿造的米酒感官评分均较低。综上,选择根霉Q1为高产糖化酶的菌株。

2.2 根霉Q1的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

菌落形态观察:采用点接法对PDA平板上的根霉Q1菌落形态进行观察,其结果如图2所不。

图2 根霉Q1培养2 d(A,B)和3 d(C,D)的菌落形态Fig.2 Colony morphology of Rhizopus Q1 cultured for 2 d(A,B)and 3 d(C,D)

由图2可知,根霉Q1菌丝前期为白色,菌丝体向四周蔓延,且菌丝较为疏松,生长较快,第2天几乎长满整个平板,菌丝呈灰白色且菌丝顶端开始出现白色孢子,第3天菌丝体呈灰色甚至黑色,孢子也由白色变为灰黑色。

显微形态观察:采用插片法对PDA平板上根霉Q1的显微形态进行观察,其结果如图3所不。

图3 根霉Q1的显微形态Fig.3 Micro-morphology of Rhizopus Q1

由图3可知,根霉Q1菌丝无横隔,假根较为发达,孢子囊呈球形或椭圆形,孢囊梗直立丛生,孢囊孢子形状较为规则、长5～8μm、有线纹。

根霉Q1在Pfeffer液和PDB培养基中于不同温度条件下的生长情况见表2。

表2 根霉Q1在Pfeffer液和PDB培养基在不同温度条件下的生长情况Table2 Growth situation of Rhizopus Q1 in Pfeffer liquid and PDB medium at different temperature conditions

由表2可知,根霉Q1在Pfeffer液和PDB中30℃和37℃温度下均可正常生长,45℃温度条件下难以生长。

根据以上结果并参照真菌鉴定手册[14]和真菌分类学[15]将根霉Q1初步鉴定为米根霉(Rhizopusoryzae)。

2.2.2 分子生物学鉴定

利用真菌18SrDNA通用引物对根霉Q1的18SrDNA序列进行PCR扩增,其扩增结果如图4所不。

图4 根霉Q1的18S rDNA序列PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification result of 18S rDNA sequence of Rhizopus Q1

由图4可知,根霉Q1扩增所得的18SrDNA基因片段在1 100 bp左右,与文献报道[10,17]结果相符。

将PCR扩增产物纯化后测序,所得序列登录NCBI数据库进行同源性比对,并选取同源性为97%以上的不同根霉种序列,采用MEGA 7.0进行比对,以NJ法构建系统进化树,结果见图5。

图5 根霉Q1基于18S rDNA序列的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of Rhizopus Q1 based on 18S rDNA sequence

由图5可知,根霉Q1与米根霉(Rhizopusoryzae)CBS112.07以及米根霉CBS278.38聚于同一分支,说明Q1与米根霉亲缘关系较近,属于米根霉种。结合形态学与分子生物学的鉴定结果,鉴定菌株Q1为一株米根霉(Rhizopusoryzae)。

2.3 米根霉Q1在孝感米酒中的应用

2.3.1 孝感米酒理化指标的分析

米根霉Q1酒曲发酵36h后,孝感米酒中的还原糖含量、总糖含量、总酸度、酒精度、GABA含量测定结果见表3。

表3 孝感米酒理化指标的测定结果Table3 Determination results of physicochemical indexes of Xiaogan rice wine

由表3可知,米根霉Q1酒曲发酵得到的孝感米酒中总糖和还原糖含量高(均＞150 mg/g),总酸度适宜(＜10 mg/g),酒精度低(1.14%vol),符合孝感米酒的特点[27]。与2.1部分中结果相比,采用根霉酒曲酿造的米酒在发酵36 h后其还原糖含量和总酸度几乎能达到接种根霉孢子液发酵米酒3 d的水平,说明酒曲酿造的米酒糖化效率高,糖化时间短,分析原因可能是酒曲中本身存在丰富的糖化酶等淀粉酶,且根霉在生长过程中又能分泌大量的糖化酶,故糖化效率高,糖化时间短。此外,米根霉Q1酒曲发酵的米酒中富含GABA,其含量可达73.75 mg/kg。

2.3.2 孝感米酒的感官评定

米根霉Q1酒曲酿造的孝感米酒发酵36 h后,对其气味、口感、色泽和组织形态进行感官评定,结果表明其发酵的米酒无异味、微酸、味甜、有米酒典型香气,符合孝感米酒的特点[27],感官得分为80分。

2.3.3 孝感米酒中挥发性风味成分分析

米根霉Q1酒曲发酵36 h后,采用GC-MS对孝感米酒中的挥发性风味成分进行分析,气质谱图经计算机和人工将每个峰与NIST Library相匹配检索定性,匹配度＞80%作为鉴定结果;根据内标法对每种物质进行定量,其结果如表4所不。

由表4结果可知,在米根霉Q1酒曲发酵36h后得到的米酒中共检测到54种挥发性风味物质,包括5种醇类、8种酯类、2种醛类、9种酮类、6种醚类、3种酸类、10种烷烃类、7种烯烃类和4种其他类;其中3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、十四酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、苯甲醛、壬醛等是米酒中的特征风味物质,这些风味物质尤其是酯类大多具有花香、水果香、甜香、发酵香等,赋予米酒独特的香气,如苯乙醇具有独特的玫瑰、月季花香,苯甲醛呈杏仁香、坚果香,癸酸乙酯具有花香、葡萄果香等[28]。由此可以看出,利用该根霉菌酿造的孝感米酒风味成分比较丰富。

表4 孝感米酒中挥发性风味成分分析结果Table4 Analysis results of volatile flavor components in Xiaogan rice wine

续表

3 结论

本研究从孝感米酒酒曲中筛选到一株高产糖化酶的根霉菌Q1,通过形态观察和18SrDNA序列分析将其鉴定为米根霉(Rhizopus oryzae)。将筛选到的高糖化力根霉菌Q1制成酒曲应用于孝感米酒的酿造,其发酵的米酒总糖(407.40 mg/g)、还原糖(221.74mg/g)和GABA(73.75 mg/kg)含量高,酸度(6.09 mg/g)适宜,酒精度(1.14%vol)低,感官鉴评(80分)好,且挥发性风味成分比较丰富,适合于孝感米酒的酿造,有利于提高孝感米酒的品质,同时也为米酒的酿造提供优良菌种资源。