响应面法优化保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺

王伟洁,秦翠丽*,王大红,2,伍家发

(1.河南科技大学 食品与生物工程学院,河南 洛阳 471023;2.洛阳市微生物发酵工程技术研究中心,河南 洛阳 471023)

乳酸菌在维持肠道菌群平衡、提高机体免疫力等方面具有重要作用,是食品领域的重要益生菌[1-3]。然而,由于乳酸菌对储藏环境条件要求比较高、对人体消化道中胃酸和胆汁耐受性差,造成其产品中菌体易失活,不能有效到达肠道发挥益生作用[4-5]。因此,采取有效措施延长乳酸菌在产品中活菌存活时间、提高其在肠道中耐受性,对其有效发挥生物活性具有重要意义。乳酸菌微胶囊技术可以大大降低外界环境条件对菌体的影响,从而显著提高菌体的抗逆性[6-7]。内源乳化法是一种常用的微胶囊技术,是将壁材、交联剂(不溶性钙盐)及芯材的混合液分散到油相中,形成油包水(W/O)体系,然后加入酸使钙离子解离并与壁材反应形成凝胶,对芯材进行包埋,可以使被包埋的芯材能够抵抗外界环境因素的破坏,因操作简便被广泛应用于食品工业领域[8-10]。

关于内源乳化法制备乳酸菌微胶囊虽有一些研究[11-14],但将果胶和海藻酸钠作为复合壁材与不溶性钙盐进行交联反应的研究还鲜见报道。果胶作为常用的食品添加剂,具有生产成本低、安全性高且交联度好的特点。因此,本试验以保加利亚乳酸菌(Lactobacillusbulgaricus)为芯材,以海藻酸钠和果胶为复合壁材,以碳酸钙为交联剂,采用内源乳化法制备保加利亚乳杆菌微胶囊,并通过响应面试验对微胶囊制备工艺进行优化,为食品工业的实际生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)ND02:河南科技大学食品与生物工程学院微生物实验室保藏。

1.1.2 试剂

海藻酸钠(食品级):郑州盛义宏生物科技有限公司;碳酸钙(食品级):南京松冠生物科技有限公司;果胶:江苏锐阳生物科技有限公司;食用油:金龙鱼集团;乳化剂Span-80:南通丰源化工有限公司。

1.1.3 培养基

MRS液体培养基:蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,葡萄糖20 g,吐温-80 1 mL,磷酸氢二钾2 g,醋酸钠5 g,柠檬酸铵2 g,硫酸镁0.2 g,硫酸锰0.2 g,加蒸馏水充分溶解后定容至1 L,115℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

DF-101S型磁力搅拌器:北京北分三普仪器有限公司;TS-100C型恒温摇床:北京市永光明医疗器械有限公司;FY-1H-N型真空抽滤器:浙江飞越机电有限公司;LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂;SW-CJ-1D型超净工作台:苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 保加利亚乳杆菌菌悬液制备

菌株活化:从保藏的斜面上刮取两环保加利亚乳杆菌接种到MRS液体培养基中,于37℃静置培养18～24 h,传代2～3次,至活菌数达1×108CFU/mL。

菌悬液的制备:将活化后的保加利亚乳杆菌按3%(V/V)的接种量接入MRS液体培养基中,于37℃静置培养16 h,重复传代2～3次,6 000 r/min、4℃条件下离心10 min,收集菌体,用体积分数为0.9%的无菌生理盐水洗涤2次,用无菌生理盐水配制成一定浓度的菌悬液。

1.3.2 保加利亚乳杆菌微胶囊的制备

将芯材(保加利亚乳杆菌菌悬液)与一定浓度的壁材(海藻酸钠、果胶)溶液混合均匀;加入CaCO3粉末,混匀;将混合液加入含一定浓度Span-80的食用油中(应边加边搅拌);再加入200μL冰醋酸,搅拌至微胶囊形成;加入250mL pH 5.5醋酸盐缓冲液,静置,使微胶囊沉降到醋酸盐水溶液底部;去除上部油相,洗涤,收集微胶囊,4℃冰箱保存。

1.3.3 保加利亚乳杆菌微胶囊包埋率的测定

微胶囊崩解液的制备:依次将28.4g磷酸氢二钠和19.2g柠檬酸溶于蒸馏水中,然后定容至1 L,并调节pH值为7.0,于115℃条件下灭菌30 min。

微胶囊包埋率的测定:取1.0 g微胶囊于50 mL微胶囊崩解液中,于37℃、180 r/min振荡2.5 h,取l mL进行平板计数。微胶囊包埋率计算公式如下:

1.3.4 保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺优化

(1)保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺优化单因素试验

以包埋率为评价指标,分别考察海藻酸钠质量分数(1%、2%、3%、4%、5%)、海藻酸钠与果胶质量比(5∶1、3∶1、1∶l、1∶3、1∶5)、水相油相体积比(1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9)、碳酸钙与壁材质量比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶6、1∶12)、乳化剂Span-80体积分数(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、搅拌速率(200r/min、300 r/min、400 r/min、600 r/min、800 r/min)对保加利亚乳杆菌微胶囊包埋效果的影响。

(2)保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺响应面优化试验

根据单因素试验结果,以包埋率(Y)为响应值,选取海藻酸钠质量分数(A)、海藻酸钠与果胶质量比(B)、水相油相体积比(C)和碳酸钙与壁材质量比(D)4个因素,进行4因素3水平的响应面分析试验,确定最优的微胶囊制备工艺,设计因素与水平见表1。

表1 保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺优化响应面试验因素与水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for Lactobacillus bulgaricus microencapsulation preparation process optimization

2 结果与分析

2.1 保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺优化单因素试验结果

2.1.1 海藻酸钠质量分数对微胶囊包埋率的影响

海藻酸钠质量分数对微胶囊包埋率影响结果见图1。

图1 海藻酸钠质量分数对保加利亚乳杆菌微胶囊包埋率的影响Fig.1 Effect of sodium alginate mass fraction on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由图1可知,当海藻酸钠质量分数为2%时微胶囊包埋率最高,达到89.7%。质量分数＜2%时,包埋率随着海藻酸钠质量分数的增加而逐渐增大,分析原因可能是当海藻酸钠质量分数逐渐加大时,凝胶反应化速度逐渐提高,形成的微胶囊机械强度逐渐增加,包埋率由79.8%提高至89.7%;当海藻酸钠质量分数＞2%之后,包埋率随着质量分数的增加逐渐降低至75.4%,分析原因可能是随着海藻酸钠质量分数的继续增加,反应体系的黏度与表面张力开始增大,导致需要包埋的菌体分散困难,从而引起包埋率降低[15]。因此,确定最优的海藻酸钠质量分数为2%。

2.1.2 海藻酸钠与果胶质量比对微胶囊包埋率的影响

海藻酸钠与果胶质量比对微胶囊包埋率的影响结果见图2。

图2 海藻酸钠与果胶质量比对保加利亚乳杆菌微胶囊包埋率的影响Fig.2 Effect of the mass ratio of sodium alginate and pectin on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由图2可知,当海藻酸钠与果胶质量比为1∶1时微胶囊包埋率最高,达到82.4%。当质量比＞1∶1时,包埋率随着质量比的减小由68.7%提高至82.4%,分析原因可能是当质量比较小时,海藻酸钠的含量相对较低,反应体系黏度降低,菌体容易分散于壁材中,所以包埋率随之升高;当质量比＜1∶1之后,包埋率随着质量比的减小由82.4%降低至72.5%,分析原因可能是当质量比继续减小时,果胶含量相对较高,使形成的微胶囊强度过大,导致被包埋在凝胶中的菌体不易被释放出来,从而造成包埋率降低。因此,确定海藻酸钠与果胶的最优质量比为1∶1。

2.1.3 水相油相体积比对微胶囊包埋率的影响

水相油相体积比对微胶囊包埋率的影响结果见图3。

图3 水相油相相体积比对保加利亚乳杆菌微胶囊包埋率的影响Fig.3 Effect of the volume ratio of water and oil phase on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由图3可知,当水相油相体积比为1∶3时微胶囊包埋率最高,达到89.2%。当体积比＞1∶3时,包埋率随着水油相体积比的降低由75.8%提高至89.2%,分析原因可能是当体积比降低时,油相体积充足,壁材和芯材在油相中的分散和乳化反应更加充分,微胶囊包埋率随之提高;但当体积比＜1∶3之后,包埋率随着体积比的减小而逐渐降低,由最大值降低至77.6%,分析原因可能是当体积比继续降低时,油相体积越来越大,形成的微胶囊颗粒因过于分散而越来越小,难以有效包埋乳酸菌,导致包埋率较低。因此,确定最优水相油相体积比为1∶3。

2.1.4 碳酸钙与壁材质量比对微胶囊包埋率的影响

碳酸钙与壁材质量比对微胶囊包埋率的影响结果见图4。

图4 碳酸钙与海藻酸钠质量比对保加利亚乳杆菌微胶囊包埋率的影响Fig.4 Effect of the mass ratio of calcium carbonate and sodium alginate on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由图4可知,当碳酸钙与壁材质量比为1∶3时微胶囊包埋率最高,为82.4%。当质量比＞1∶3时,包埋率随质量比减小由68.6%提高至82.4%,分析原因可能是当质量比减小时,壁材含量较高,钙离子结合位点充分,可以大量生成微胶囊,包埋率也随之提高;但是当质量比＜1∶3之后,包埋率随质量比的减小而逐渐降低至72.6%,分析原因可能是当质量比继续减小时,体系中与壁材发生交联反应的钙离子相对越来越少,交联反应有限,无法包埋更多的乳杆菌,导致包埋率降低。因此,确定碳酸钙与壁材的最优质量比为1∶3。

2.1.5 乳化剂体积分数对微胶囊包埋率的影响

乳化剂体积分数对微胶囊包埋率的影响结果见图5。

图5 乳化剂体积分数对保加利亚乳杆菌微胶囊包埋率的影响Fig.5 Effect of emulsifier volume fraction on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由图5可知,在乳化剂体积分数为1.5%时微胶囊的包埋率最高,为78.6%。当乳化剂体积分数＜1.5%时,微胶囊包埋率随着乳化剂体积分数的增大而升高,由75.5%升高至78.6%,分析原因可能是因为乳化剂体积分数的增加使反应体系的表面张力增大,利于反应物分子的扩散,易于发生交联反应;当乳化剂体积分数＞1.5%之后,微胶囊包埋率随着乳化剂体积分数的增大逐渐降低,分析原因可能是水相和油相界面处乳化剂分子较多,阻碍冰醋酸顺利通过,导致碳酸钙解离困难,从而阻碍碳酸钙与壁材之间的反应[16],导致微胶囊包埋率减小。因此,确定最优乳化剂体积分数为1.5%。

2.1.6 搅拌速率对微胶囊包埋率的影响

搅拌速率对微胶囊包埋率的影响结果见图6。

图6 搅拌速率对保加利亚乳杆菌微胶囊包埋率的影响Fig.6 Effect of stirring speed on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由图6可知,微胶囊包埋率随着搅拌速率的增加呈增大趋势,由72.3%提高至77.1%,分析原因可能是随着搅拌速率的增大,溶液乳化更加充分,使得包埋率逐步提高。但当搅拌速率＞400 r/min之后,微胶囊包埋率增速变缓,分析原因可能是搅拌速率为400 r/min时,已能够使溶液充分乳化,增加速率对微胶囊包埋效果无明显影响[17]。因此,确定400 r/min为最优搅拌速率。

2.2 保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺条件优化响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果

根据单因素试验结果,选择对包埋率影响较为显著的因素海藻酸钠质量分数(A)、海藻酸钠与果胶质量比(B)、水相油相体积比(C)、碳酸钙与壁材质量比(D)为变量,以包埋率(Y)为响应值进行响应面优化试验,响应面试验结果见表2,方差分析见表3。

利用软件Expert Design 8.0对表2试验结果进行分析,得到4个影响因素与包埋率之间的二次回归方程:

表2 保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺条件优化响应面试验设计与结果Table2 Design and results of response surface experiments for Lactobacillus bulgaricus microencapsulation preparation process optimization

表3 回归模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

续表

由表3可知,微胶囊制备工艺的二次模型P=0.017 5＜0.05,说明该模型显著(P＜0.05),失拟项P=0.054 3＞0.05,不显著(P＞0.05),说明该模型可信度高,可以用于分析和预测保加利亚乳杆菌微胶囊制备工艺的优化程度。回归方程各项方差分析结果表明,4个因素对微胶囊包埋率的影响主次顺序为海藻酸钠与果胶质量比(B)＞碳酸钙与壁材质量比(D)＞水相油相体积比(C)＞海藻酸钠质量分数(A),交互项AD、BD、CD对响应值影响显著(P＜0.05),交互项AB、AC、BC对响应值影响不显著(P＞0.05);二次项A2对响应值影响极显著(P＜0.01),B2、C2、D2对响应值影响不显著(P＞0.05)。

2.2.2 模型验证

通过回归模型分析,得到保加利亚乳杆菌微胶囊制备的最佳工艺条件:海藻酸钠质量分数1.89%,海藻酸钠与果胶质量比1∶1,水相油相相体积比1∶2.59,碳酸钙与壁材质量比1∶2.12,为方便操作,将以上数据修正为:海藻酸钠质量分数为2%,海藻酸钠与果胶质量比1∶1,水相油相体积比1∶2.5,碳酸钙与壁材质量比1∶2,乳化剂Span-80体积分数1.5%,搅拌速率400 r/min,以此条件进行验证试验,3次试验的平均包埋率为91.8%,基本与模型的预测值92.7%相符。

3 结论

通过单因素及响应面试验优化了内源乳化法制备保加利亚乳杆菌微胶囊的工艺条件,得到最佳的工艺参数:海藻酸钠质量分数2%,海藻酸钠与果胶质量比1∶1,碳酸钙与壁材质量比1∶2,水相油相体积比1∶2.5,乳化剂Span-80体积分数1.5%,搅拌速率400 r/min,在此优化条件下,微胶囊的包埋率达到91.8%。本研究优化的工艺参数可为食品工业的实际生产提供参考依据。