不同发酵方式下甘蓝泡菜中有机酸的HPLC分析

王芮东,卫博慧,李 楠,杨金菊

(1.运城学院 理科实验中心,山西 运城 044000;2.运城学院 生命科学系,山西 运城 044000)

泡菜是利用浓度较低的盐水来腌渍新鲜蔬菜,并通过乳酸菌厌氧发酵制成的具有咸酸口味的浸渍品[1-4],其营养丰富,含有较高的碳水化合物、蛋白质、氨基酸和维生素等营养成分[5-6],并且具有抗突变活性、抗癌以及抗衰老等作用[7-9]。泡菜的发酵方式主要包括传统发酵和纯种发酵2种方式,家庭、小作坊等生产以传统发酵方式为主,在蔬菜中按一定比例加入盐水、自制泡菜菌水以及老泡菜水等进行自然发酵,如:自然发酵、自制泡菜菌发酵和老泡菜水发酵等;大规模的工业化生产主要应用纯种发酵方式,在蔬菜中加入盐水后接入一定的乳酸菌菌种来进行发酵[10-11]。

有机酸是形成泡菜特色酸性风味的物质,泡菜中含有多种有机酸,分别来源于新鲜蔬菜、泡菜发酵过程和食品添加剂[12]。泡菜质量检测的重要指标之一是有机酸含量的检测,目前对于泡菜中有机酸含量测定的文献较少,王冉等[13]用反相高效液相色谱(reversed-phasehigh performance liquid chromatography,RP-HPLC)法测定泡菜中的有机酸;张坤等[14]用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)同时测定泡椒中的6种有机酸;邹辉等[15]以白菜为原料自然腌制泡菜,采用高效液相色谱法和分光光度法,测定腌制过程中有机酸的种类及含量、亚硝酸盐的含量,并进行有机酸对亚硝酸盐降解实验,研究了泡菜中有机酸及其对亚硝酸盐含量的影响。

本试验采用高效液相色谱法对自然发酵、纯种发酵、自制泡菜菌发酵和老泡菜水发酵4种不同发酵方式制作的甘蓝泡菜中的有机酸进行测定,比较不同发酵方式生产的泡菜中各有机酸种类和含量的差异,以期为泡菜生产工艺的深入研究提供一定数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蓝(卷心菜):运城市佳缘超市;泡菜乳酸菌发酵粉:北京川秀科技有限公司制造;高粱酒(53%vol):山西省春玉酒业有限公司;磷酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为分析纯)、甲醇(色谱纯):天津市大茂化学试剂厂;草酸、柠檬酸、丙酸、琥珀酸、DL-苹果酸、乳酸、酒石酸、乙酸、抗坏血酸标准品:美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

LC1200型高效液相色谱仪、Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm):美国Agilent公司;FHS-3C型pH计:上海仪电科学仪器股份有限公司;TDL6M型大型离心机:长沙湘智离心机仪器有限公司;TG16MW型台式高速离心机:湖南赫西仪器装备有限公司;JJ/2型组织捣碎匀浆机:江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;KQ-300GDV型数控超声波清洗仪:昆山市超声仪器有限公司;FA1604型电子天平:上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制作

甘蓝经挑选、整理、清洗、沥干、切分后装入泡菜坛中,按照下列不同操作方式分别进行自然发酵、纯种发酵、自制泡菜菌发酵和老泡菜水发酵。

自然发酵:按甘蓝与食盐水(食盐水质量浓度为6g/100mL,下同)质量比1∶2的比例装入泡菜坛,密封、室温发酵。

纯种发酵:按甘蓝与食盐水质量比1∶2的比例装入泡菜坛,同时加入总质量0.3%的泡菜乳酸菌发酵粉,密封、室温发酵。

自制泡菜菌发酵:将高粱酒(53%vol)与食盐水按体积比1∶20混合,然后加入总质量5%的青椒,密封、室温发酵5～6 d,待青椒变黄后,自制泡菜发酵菌制成。按甘蓝与自制泡菜菌液质量比1∶2的比例装入泡菜坛,密封、室温发酵。

老泡菜水发酵:使用以前自然发酵制作泡菜的老泡菜水,按甘蓝与老泡菜水质量比1∶2的比例加入到泡菜坛,密封、室温发酵。

1.3.2 样品处理

参照杨君等[15-16]的方法并加以改进。准确称取发酵第7天的甘蓝泡菜和汁液各50.0g,一起放入组织捣碎机捣碎成浆,将其作为有机酸、总酸度、pH值等测定的储备样品使用。称取上述储备样品5.00g于离心管中,以转速为4 000r/min离心15 min,准确吸取上清液15 mL加入10 mL超纯水,于75℃超声波处理20min,再以12000r/min离心15min,上清液经0.22μm滤膜过滤至2 mL进样瓶中待色谱测定。

1.3.3 有机酸测定

(1)色谱条件

Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);检测器:可变波长扫描紫外检测器(variable-wavelength ultraviolet detector,VWD);流动相:甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾(3∶97,V/V)(用磷酸调节pH值为2.8);检测波长:分别对9种有机酸的标准溶液进行全波长扫描(190～400nm),确定样品的检测波长;进样量:10μL;流速:1mL/min;柱温:室温。

(2)标准曲线绘制

分别精密称取草酸、抗坏血酸各18 mg,酒石酸75 mg,苹果酸、柠檬酸、乳酸、乙酸各300 mg,琥珀酸700 mg,丙酸3 000 mg,用流动相溶解并定容至50 mL的容量瓶中,得到0.36 mg/mL的草酸、抗坏血酸,6 mg/mL苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸,1.5mg/mL酒石酸,14 mg/mL琥珀酸,60 mg/mL丙酸的混合有机酸母液。将母液用流动相稀释为2、4、6、8、10、12倍,得到不同浓度梯度的有机酸标准溶液:草酸、抗坏血酸(0.18mg/mL、0.09mg/mL、0.06mg/mL、0.045mg/mL、0.036 mg/mL、0.03 mg/mL)、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸(3 mg/mL、1.5 mg/mL、1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.6 mg/mL、0.5 mg/mL)、酒石酸(0.75 mg/mL、0.375 mg/mL、0.25 mg/mL、0.188 mg/mL、0.15 mg/mL、0.125 mg/mL)、琥珀酸(7 mg/mL、4.25mg/mL、2.33mg/mL、1.75mg/mL、1.4mg/mL、1.167mg/mL)、丙酸(30 mg/mL、15mg/mL、10mg/mL、7.5mg/mL、6mg/mL、5mg/mL),经0.22μm滤膜过滤至2mL进样瓶中,进样,以峰面积(y)对质量浓度(x)求标准曲线回归方程和相关系数。

(3)样品测定

将处理后的样液进行HPLC分析,进样量为10μL,采用外标法进行定量。

1.3.4 总酸度测定

采用酸碱滴定法测定总酸(以乳酸计)含量[17],准确称取上述储备样品10 g于250 mL容量瓶中定容,过滤后取滤液50 mL,用0.1 mol/L NaOH标准溶液进行滴定,每个样液平行3次,求平均值。

1.3.5 pH值测定

采用精密pH计测定[18],准确称取上述储备样品50.0 g,加入10mL蒸馏水,搅拌均匀后进行测定,每个样液平行3次,求平均值。

1.3.6 数据分析

在Agilent ChemStion工作站,根据色谱图中样品的保留时间和标准品的保留时间比对进行定性分析,根据各有机酸的峰面积和标准曲线对样品中的有机酸进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 有机酸测定结果

2.1.1 有机酸标准混合液HPLC分析

在上述色谱条件下,有机酸混合标准溶液的高效液相色谱图见图1。

由图1可知,9种有机酸分离效果良好,保留时间分别为草酸3.306 min、酒石酸3.737 min,D-苹果酸4.693 min、乳酸5.179 min、抗坏血酸5.445 min、乙酸5.808 min、L-苹果酸8.036 min、柠檬酸8.973 min、琥珀酸9.240 min、丙酸12.826 min。

图1 有机酸混合标样的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed organic acid standards

2.1.2 标准曲线回归方程

将不同浓度梯度的有机酸混合标准溶液进行HPLC分析,对测得值进行相关系数分析和线性回归分析,结果见表1。

由表1可知,9种有机酸分别在其线性范围内,相关系数(R2)均＞0.991,结果表明各有机酸的峰面积与质量浓度的线性相关性良好,在此条件下可以很好地测定有机酸的含量。

表1 有机酸标准曲线的线性回归方程,相关系数及线性范围Table1 Regression equations,correlation coefficients and linear range of standard curves of organic acids

2.1.3 精密度试验

将稀释10倍的有机酸混合标准液连续进样6次,根据所得峰面积分别计算精密度,结果见表2。由表2可知,9种有机酸的峰面积测定结果相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)范围为0.004 2%～0.161 2%,表明该方法的精密度良好。

表2 测定方法的精密度试验结果(n=6)Table2 Results of precision tests of the method(n=6)

2.1.4 重复性试验

精密称取纯种发酵方式的泡菜样品6份,按1.3.1节方法处理后,按上述色谱条件进样分析,测得各有机酸的峰面积,结果见表3。由表3可知,测定结果重复性RSD范围为0.503%～5.687%,表明该方法的重复性均达到分析的要求。

表3 测定方法的重复性试验结果(n=6)Table3 Results of repeatability tests of the method(n=6)

续表

2.1.5 回收率试验

精密称取以纯种发酵方式制作的泡菜和汁液各50.0g,按1.3.2方法制备样品储备液。测定每种有机酸样品储备液4份,其中1份作为本底,另3份分别添加低、中、高3个水平有机酸标准溶液,分别预处理后进行色谱分析,其中低、中、高3水平每个水平进行3次平行测定,结果见表4。由表4可知,9种有机酸的回收率在94.2%～105.4%之间,说明该方法的准确度较高。

表4 有机酸测定的加标回收率实验结果Table4 Results of adding recovery rate tests of the organic acids

2.1.6 甘蓝泡菜样品中有机酸的测定结果

在上述色谱条件下,对四种不同发酵方式的甘蓝泡菜样品进行测定,四种不同发酵方式的泡菜样品的色谱图分别见图2,有机酸测定结果见表5。

图2 自然发酵(A),纯种发酵(B),自制泡菜发酵菌发酵(C)及老泡菜水发酵(D)泡菜中有机酸分析的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of organic acid of pickles made by natural fermentation(A),pure-culture fermentation(B),homemade pickles fermentation(C)and aged pickles water(D)

表5 四种不同发酵方式的甘蓝泡菜中有机酸含量Table5 Organic acids contents in cabbage pickles by four fermentation methods

由表5可知,自然发酵和纯种发酵方式的泡菜中9种有机酸均被检出,老泡菜水发酵方式的泡菜检出8种,琥珀酸未被检测出;自制泡菜发酵菌泡菜检出7种,琥珀酸和柠檬酸未被检测出;四种发酵方式的泡菜中有机酸总量从大到小顺序为:纯种发酵＞老泡菜水发酵＞自制发酵菌发酵＞自然发酵,四种发酵方式泡菜中共有的有机酸有:草酸、酒石酸、DL-苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、丙酸,各主要有机酸含量大小顺序均为:草酸＞乳酸＞抗坏血酸＞酒石酸＞DL-苹果酸,这与王冉等[21-23]的研究的结果相似。草酸、抗坏血酸含量高主要是由于蔬菜原料卷心菜本身含有大量的草酸和抗坏血酸,乳酸含量高是由于乳酸菌为泡菜的主要发酵菌,通过乳酸发酵会使乳酸含量增加[24];泡菜中的每种有机酸呈现的酸味特征不同,但均为泡菜的特色风味物质,单一的有机酸口味比较平淡,多种有机酸的共同作用能够赋予泡菜更加可口的风味[25]。

2.2 泡菜样品总酸度及pH值测定结果

采用酸碱滴定法和pH计对四种不同发酵方式的泡菜样品中总酸度和pH值进行测定,结果见表6。

表6 四种不同发酵方式的泡菜总酸度和pH值Table6 Total acidity and pH value of cabbage pickles made by four fermentation methods

由表6可知,四种不同发酵方式的泡菜总酸度在0.76～0.92 g/100 mL范围内,从大到小顺序为:纯种发酵＞老泡菜水发酵＞自制泡菜菌发酵＞自然发酵,这与柳建华等[26]研究结果一致,这是由于汁液是泡菜中乳酸菌发酵的主环境,纯种发酵的乳酸菌是经过筛选的具有耐酸能力的菌种,老泡菜水是经过较长时间筛选的泡菜水[27],两者的乳酸菌总数均高于其他两种发酵方式的乳酸菌总数,且乳酸菌代谢活动比较旺盛,酸的生成速率较快[28]。

四种不同发酵方式的泡菜pH值范围在3.95～4.73,由大到小顺序为:自然发酵＞自制泡菜菌发酵＞老泡菜水发酵＞纯种发酵,这是由于纯种发酵泡菜的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)M1产酸能力强,生长繁殖快,对pH的耐受能力强,而自然发酵泡菜中发酵启动慢,原料自身携带的发酵乳酸菌产酸能力弱所致[29]。

3 结论

本试验采用AgilentTC-C18色谱柱,经过精密度(0.0042%～0.161 2%)、重复性(0.503%～5.687%)、回收率(94.2%～105.4%)等方法学的考察,建立了一种HPLC同时测定四种不同发酵方式泡菜中9种有机酸的分析方法,该方法具有简便、快速、准确、重复性好等优点。应用此方法测定出四种不同发酵方式泡菜中共有的有机酸有7种:草酸、酒石酸、DL-苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、丙酸,各主要有机酸含量大小顺序为:草酸＞乳酸＞抗坏血酸＞酒石酸＞DL-苹果酸,不同发酵方式的泡菜中总有机酸量从大到小依次为:纯种发酵＞老泡菜水发酵＞自制发酵菌发酵＞自然发酵。