乳果糖生产方法及其在肉鸡生产中的应用

吕路芳， 谢文惠， 姜 宁， 张爱忠

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

乳果糖（4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖）是由一分子果糖和一分子半乳糖，通过β-1,4-糖苷键结合的不易消化的双糖（Wang等，2013）。作为人工合成的双糖，乳果糖的合成主要通过化学异构法和酶法催化，但这两种方法都有其局限性。考虑到合成的可行性和环境因素，相比于化学异构化，以酶法催化合成乳果糖更具吸引力。乳果糖在人类食品中已被广泛应用，在肉鸡生产中应用较少，因此本文介绍了化学法和酶法催化（例如糖苷酶和糖基转移酶）生产乳果糖，并对乳果糖在肉鸡生产中的应用进行了总结，同时对乳果糖生产技术未来的发展进行了展望，以期为乳果糖在畜禽等方面的后续开发与利用提供一定的理论基础。

1 化学法合成乳果糖

1.1 化学异构化合成乳果糖 早在 1895年，Lobry de Bruyn和Van Ekenstein发现还原性糖在碱性溶液中会发生异构化反应生产非还原性糖，此类碱催化的醛糖-酮糖异构化反应被称为洛布雷·德·布律-埃肯施泰因转化反应 （沈秋云，2015）。1929年，Montgomery通过使用弱氢氧化钙溶液（石灰水）对乳糖异构化合成了乳果糖。乳糖化学异构化为乳果糖方法，其过程可以使用酸（石灰，硫酸）、碱（三乙胺、氢氧化钠、氧化镁和亚硫酸盐）和两性催化剂 （羟基、亚硫酸盐和硼酸盐）（Aider等，2007）。 通过洛布雷·德·布律-埃肯施泰因转化反应将葡萄糖异构化成果糖基 （图1）（Schuster等，2010），基本原理为还原性乳糖在热处理过程中，经过化学催化剂的催化作用，将乳糖上的葡萄糖直接异构化为果糖从而得到乳果糖。

1.2 电化学反应合成乳果糖 已有研究表明，在电化学催化方法的基础上可以电活化合成乳果糖（Ait等，2014）。通过高浓度碱在反应介质中自动发电，这种方法被认为是一种新型节能技术。然而，这种技术产率远远低于化学异构化合成产率，所以在电化学反应合成乳果糖的研究至今还比较少。

2 酶法催化合成乳果糖

用于乳糖转化成乳果糖的催化剂必须很容易从最终产物中去除，并且安全无毒和廉价环保。因此，酶法催化合成乳果糖是一个好的选择。目前有两种酶类能够催化乳果糖合成，即糖苷水解酶与纤维二糖差向异构酶（Mayer等，2004）。这两类酶中，糖苷水解酶（如β-半乳糖苷酶）更适于工业生产，其在市面上已有销售，且价格低廉，已被广泛应用于食品行业，特别是无乳糖乳制品中。

图1 葡萄糖异构化成果糖基示意图（Schuster等，2010）

2.1 通过β-半乳糖苷酶催化合成乳果糖 β-半乳糖苷酶又称乳糖酶，是乳糖水解酶，可催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，在乳糖水解过程中，乳糖本身也可以作为一个受体，与此同时，也会产生低聚半乳糖（GOS）。β-半乳糖苷酶首先作用于乳糖释放葡萄糖并形成酶-半乳糖中间复合物，当半乳糖基受体是水时形成半乳糖，当受体是果糖时则发生转半乳糖基反应而得到乳果糖。因此，乳果糖是通过转半乳糖苷酶催化乳糖和果糖合成的，高浓度的乳果糖通过某些酶 （如β-半乳糖苷酶）的作用容易发生次级水解成半乳糖和果糖。

2.2 微生物酶对乳果糖的转糖基作用 从乳糖和果糖酶促合成乳果糖早在1978年已有报道，当时Vaheri和Kaupinnen利用脆壁酵母β-半乳糖苷酶催化乳糖的转糖苷反应，乳果糖的产量达到7.8 g/L，得率只有3%左右。除了果糖之外，其他的亲核试剂，如水、乳糖和低聚半乳糖都可以作为水溶液中乳果糖的合成所产生的半乳糖基受体。通过这些受体之间的竞争，对反应选择性和得率都有很大的影响（Panesar等，2011）。

酶的浓度也显著影响反应速率。Sitanggang等（2016）研究得出，在较高的酶浓度下（＞15 U/mL），原发性水解（乳糖水解）和次级水解（乳果糖水解）降解更快；此外，该研究还表明必须考虑酶浓度与乳糖初始量的比值以提高反应速率，提出了用互补酶使葡萄糖异构化合成果糖的方法，因为其是动力学控制，次级水解后所得的乳果糖浓度达到最高。

同时应该避免次级水解而增加的非生产性时间，使乳果糖持续合成，例如：酶膜反应器（EMR）、微通道（MC）或填充床反应器（PBR）（Sitanggang等，2014）。特别是在EMR固定体积下，没有固相酶也可以持续合成乳果糖。酶分子可以保留在柱子内的膜上，同时使产品、副产品和底物渗透下来。EMR系统的连续运行，可以改善连续生产中因为次级水解而使乳果糖降解的问题。也有很多研究利用PBR使乳糖（乳清蛋白）和果糖连续合成乳果糖。一种新型的具有激活壁的微通道系统被认为是一种可替代乳果糖连续合成的新技术，然而，微反应器的活性壁的制备比较复杂。有相关研究得出在微反应器中，用功能化多壁碳纳米管固定的β-半乳糖苷酶催化合成乳果糖，48 h内乳果糖的浓度保持在1.29 g/L（Song等，2012）。

2.3 通过纤维二糖差向异构酶合成乳果糖 低反应收率和在功能性食品市场对乳果糖的需求增加，要求我们需要进一步研究生产乳果糖更加便宜的酶催化剂。有相关研究报道纤维二糖差向异构酶可以催化β-1,4-糖苷键连接的低聚糖还原端 D-葡萄糖基差向异构化为 D-甘露糖基（Park等，2011）。有些纤维二糖差向异构酶还可以催化还原端 D-葡萄糖基异构化为D-果糖基，即可以催化乳糖转化为乳果糖。Kim等（2012）用糖热解纤维素果汁杆菌纤维二糖异构酶（CsCE）催化乳糖反应，在确定的最适条件（pH 7.5，80 °C，700 g/L乳糖）下，乳果糖产量可达 408 g/L，乳果糖的转化率为58%，同时有约15%的底物乳糖转化为依匹乳糖。另有研究在CsCE催化乳果糖合成的反应体系中加入硼酸盐 （摩尔比，硼酸盐∶乳糖=1∶1），乳果糖的产量提高到 616 g/L，转化率提高到88%（Kim 等，2013）。Shen 等（2016）采用随机诱变CsCE产生纤维二糖差向异构酶，经过四次连续的随机突变和筛选，得到一个最佳的G4-C5突变酶，这个G4-C5突变酶可以使乳果糖合成收益率为76%，并且在异构化的时候不会产生依匹乳糖。乳果糖在合成的过程中，纯化有一定程度的复杂性。最近研究表明，乳糖通过异构化合成乳果糖的最佳条件是80°C，pH为7.5的Hepes缓冲溶液。在此条件下，乳果糖在90 min内浓度迅速增加，在3 h内达到稳定状态，虽然是分批合成，但并没有观察到乳果糖有分解的现象 （Shen等，2016）。

通过利用CsCE合成乳果糖，酶法催化与化学异构化反应的产率基本一致。以随机诱变的方法生产G4-C5酶，并在EMR固定体积下进行连续操作，酶法催化合成乳果糖可能比化学异构化更有效。可以简化分离回收乳果糖的步骤，从而降低生产成本，但是，为了使其能够工业化生产，必须建立酶 （例如G4-C5纤维二糖差向异构酶）的工业生产；此外，乳果糖作为功能性食品，其生产所用必须仅限于具有 （一般公认安全）（GRAS）和（食品及药物管理局）（FDA）的认定，这些限制性问题希望在未来的研究中能够解决。

3 乳果糖在肉鸡生产中的应用

乳果糖对双歧杆菌具有增殖效果，在食品工业中往往被作为功能性食品添加剂或双歧因子使用。乳果糖是一种合成的二糖，不被胃肠道自身的酶分解，进入小肠后被双歧杆菌产生的β-半乳糖苷酶分解而成为双歧杆菌的碳源，促进双歧杆菌的生长，酸化肠道环境，降低肠道还原电位，抑制有害菌生长。乳果糖还被欧盟饲料和食品质量安全管理局（Quality and Safety of Feeds and Food for Europe；European Commission 2011）认定为一种新型饲料添加剂，其可通过促进双歧杆菌和乳酸杆菌增殖，抑制沙门氏菌的生长，提高肉鸡对肠道疾病的免疫力，从而减少抗生素在饲料中的使用（郑排云等，2017）。

3.1 乳果糖对肉鸡生产性能和屠宰性能的影响黄海滨等（2012）研究表明，添加不同水平乳果糖替代饲用抗生素后肉仔鸡的活体重、平均日增重、平均日采食量较抗生素组均有所提高，较阴性对照组均有降低料重比的趋势；添加0.5%、1.0%乳果糖的肉仔鸡宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、腿肌重均优于抗生素组，并且添加0.5%、1.0%的乳果糖在一定程度上降低了肉仔鸡的脂肪沉积；综合乳果糖对肉仔鸡生产性能及胴体品质的影响，其中以1.0%乳果糖替代饲用抗生素的效果较佳。李虎等（2011）研究报道，在黄羽肉鸡基础日粮中添加不同剂量的乳果糖，能达到与添加抗生素相当的效果，从期末平均体重、平均日增重、平均日采食量、料重比、死亡率等因素综合评价，在黄羽肉鸡日粮中添加5 g/kg的乳果糖可以替代饲用抗生素；79日龄时活体重、屠体重、全净膛重、半净膛重、胸肌重、腿肌重、腹脂重方面与添加饲用抗生素组相比有升高趋势；屠宰率、半净膛率、腿肌率方面与用抗生素组效果相当；全净膛率、胸肌率方面，与饲用抗生素组相比略有降低。就屠宰性能方面而言在黄羽肉鸡基础日粮中添加5 g/kg乳果糖可以替代饲用抗生素。Gheisar等（2016）在基础日粮中添加0.25%和0.5%的乳果糖，结果表明在肉仔鸡8～21日龄、21～35日龄和0～35日龄，都能显著提高平均日增重 （P＜0.05）和降低料重比（P＜0.05），饲喂添加水平为0.5%乳果糖的肉仔鸡胸脯肉相对重量高于其他组，滴水损失率下降（P＜0.05）。

3.2 乳果糖对肉鸡肠道菌群和肠道黏膜形态的影响 崔彪等（2012）研究表明，在基础日粮中添加5 g/kg乳果糖替代黄羽肉鸡饲用抗生素与阴性对照组相比，乳果糖组肠道内容物中细菌数量及回肠内容物总酸的浓度提高，肠黏膜蛋白质中溶菌酶的含量、十二指肠黏膜蛋白质中SIgA含量提高，并且这种作用在45日龄时强于77日龄。唐倩等（2012）研究结果显示在日粮中添加不同水平乳果糖在一定程度上促进了小肠对营养物质的吸收和利用，显著提高了十二指肠、空肠和回肠绒毛高度，降低了隐窝深度，乳果糖使肠道内容物中的丁酸含量增加，有利于肉仔鸡肠道结构和功能的发育和修复受损后的肠道，其中以1.0%的添加量最好。Zhao等（2016）研究结果表明，饲喂0.15%乳果糖降低了14日龄粪便中的大肠杆菌数 （P＜0.05），提高了14和35日龄粪便中的乳酸菌数（P＜0.05）。Calik等（2015）在以玉米-豆粕基础日粮中添加 0%、0.2%、0.4%、0.6%和 0.8%的乳果糖，在42日龄时，添加不同水平乳果糖的肠道杯状细胞与空白对照组相比无明显差异，对盲肠中各菌群并没有起到饮食治疗的作用。7日龄和42日龄时测得肉鸡的总挥发性脂肪酸结果显示乳果糖能显著增加和补充乙酸、丙酸和丁酸的浓度。

4 总结与展望

由于功能性食品市场对乳果糖的需求不断增加，应该对如何经济有效地合成乳果糖作出更多研究。通过纤维二糖异构酶固有的催化能力，与化学异构化法相比乳糖异构化合成乳果糖与其反应产率相同，且不会产生副产物（依匹乳糖）。建议使用CsCE G4-C5纤维二糖差向异构酶EMR固定体积，可以简化乳果糖的分离和纯化过程，与化学异构化相比，这可以降低生产成本。为了经济有效的合成乳果糖，应该对异构酶制剂安全问题及其商业可用性进行更深入的研究。