高效液相色谱法同步测定添加剂预混合饲料中六种水溶性维生素

张 憬，梁 斌，吴志奇，祝秀梅，戴海洁，南玉琴

（甘肃省兽药饲料监察所，甘肃兰州 730030）

水溶性维生素对于畜禽养殖是重要的营养成分，其可参与蛋白质、脂肪等的代谢，能够提高免疫能力、预防疾病等。目前对于多种维生素的同步检测都是高效液相色谱法，但是所用提取液、流动相、采集波长千差万别。为验证并找到一个理想的检测方法，节约时间成本，本实验选择了常见的六种B族维生素：烟酸、烟酰胺、叶酸、硫胺（维生素 B1）、核黄素（维生素 B2）、盐酸吡哆醇（维生素B6），比较不同波长、不同色谱柱温、不同提取方法，以获得最佳检测条件。

1 材料与方法

1.1 提取液 在已装入700 mL去离子水的1000 mL容量瓶中，加入50 mg EDTA，振摇溶解后再加入25 mL冰乙酸、5 mL三乙胺，用去离子水定容摇匀。

1.2 流动相 流动相A：在已装入700 mL去离子水的1000 mL容量瓶中，加入50 mg EDTA、1.1 g庚烷磺酸钠，振摇溶解后再加入25 mL冰乙酸、5 mL三乙胺，用去离子水定容摇匀。用冰乙酸、三乙胺调节pH值至3.40，过0.45μm滤膜，超声脱气，待用。

流动相B：甲醇，色谱纯。

流动相 A：流动相 B=91∶9。

1.3 标准溶液

1.3.1 烟酸贮备液 准确称取标准品0.0250 g于25 mL棕色容量瓶，用去离子水溶解定容，此溶液浓度为 1000μg/mL。

1.3.2 烟酰胺贮备液 准确称取标准品0.0250 g于25 mL棕色容量瓶，用去离子水溶解定容，此溶液浓度为 1000μg/mL。

1.3.3 叶酸贮备液 准确称取标准品0.0500 g于50 mL棕色容量瓶，加入40 mL去离子水振摇，滴加0.25 mol/L氢氧化钠，用最少量使叶酸溶解（因叶酸水溶性差，用氢氧化钠将叶酸转化为叶酸盐），用去离子水溶解定容，此溶液浓度为1000μg/mL。

1.3.4 维生素B1贮备液 准确称取标准品0.0250 g于25 mL棕色容量瓶，用25%乙醇溶液溶解定容，此溶液浓度为1000μg/mL。

1.3.5 维生素B2贮备液 准确称取标准品0.0100 g于100 mL棕色容量瓶，加入2 mL去离子水、1 mL冰乙酸，在沸水浴80～100℃煮沸30 min，冷却至室温后用去离子水定容，此溶液浓度为 1000μg/mL。

1.3.6 维生素B6贮备液 准确称取标准品0.0250 g于25 mL棕色容量瓶，用0.1 mol/L盐酸溶解定容，此溶液浓度为1000μg/mL。

1.3.7 混合标准中间液 分别准确吸取六种标准贮备液2.50 mL至50 mL棕色容量瓶中，用流动相定容。各组分浓度均为50μg/mL。

1.3.8 混合标准系列工作溶液 依次准确吸取混合 标准 中 间 液 0.30、0.60、1.00、1.50、2.00 mL 至50 mL棕色容量瓶，用流动相定容。得到系列曲线溶液，浓度分别为 0.3、0.6、1.0、1.5、2.0 μg/mL 。

1.4 仪器和设备 安捷伦高效液相色谱仪1100；pH计；恒温水浴锅；超声波清洗器。

1.5 液相色谱条件 色谱柱：Poroshell 120 SBC18，4.6 mm×150 mm，粒度 2.7 μm；检测器：DAD 检测器；流动相流速：0.65 mL/min；进样体积：10 μL。

2 结果与分析

2.1 不同波长下的数据采集 参考GB/T 14700（2002）、GB/T 14701 （2002）、GB/T 14702（2002）、陈金泉等（2012）对复合维生素B片中多种维生素检测的研究及张媛媛等（2017）对高效液相检测复合维生素片的研究，提及多个检测波长，此次共设置有 214、246、267、280 nm， 经检测发现，214 nm和246 nm条件下基线不稳定，组分出峰不理想，在267 nm和280 nm波长下基线稳定，故最终选择267、280 nm两个波长同时采集数据。

2.2 不同色谱柱温对测定的影响 共比较了三种柱温：30、35、40℃。 经过比较发现，30℃和40℃下，维生素B1和维生素B2分离效果都比较差，特别是在40℃，维生素B1被维生素B2完全包容。故最终选择35℃柱温。

2.3 标准曲线 在流动相0.65 mL/min流速，柱温35℃，267、280 nm双波长下采集标准系列溶液，各组分能够很好地分离，且各组分相关系数为0.99964～0.99998。

图1中，峰1为烟酸，峰2为烟酰胺，峰3为维生素B6，峰4为叶酸，峰5为维生素 B1，峰6为维生素 B2， 出峰时间分别为 2.993、4.153、6.474、10.393、17.758、19.098 min。图 1 上半部为 267 nm波长图谱，下半部为280 nm波长图谱。由图1可以看出，烟酸、烟酰胺、维生素B1和维生素B2在267 nm波长下相应值高，叶酸和维生素B6在280 nm波长下响应值高。

图2为六个组分中响应值最低的维生素B1在0.30～2.00μg/mL浓度范围的标准曲线，由图可以看出，相关系数仍然可以达到0.99964，对于组分的外标法定量非常理想。

2.4 样品提取 样品提取方法主要有超声提取和沸水浴（90℃）提取。精确称取水溶性维生素预混料0.1600 g于50 mL棕色容量瓶，加入约35 mL提取液振摇后采用两种提取法分别提取30 min，冷却至室温后用提取液定容摇匀，过0.45μm注射器滤膜过滤，上高效液相色谱仪测定。

图3为水浴提取法样品图谱。两种提取方法均可从维生素预混合饲料中提取出六种组分，没有其他杂峰影响这六种维生素的定量。

图1 1.0μg/mL标准溶液图谱

图2 标准曲线

图3 样品图谱

由表1可以看出，六种组分超声提取法均比水浴提取法检测值偏低，尤其叶酸，超声提取仅为水浴提取的31%，因此样品提取应采用沸水浴提取。

2.5 添加回收及精密度试验 称取0.16 g不含水溶性维生素的预混合饲料于50 mL棕色容量瓶中，加入1 mL 50μg/mL混合标准中间溶液，采用样品提取同样的方法，用沸水浴提取30 min，在与标准曲线相同的色谱条件下测定，测定结果见表2。

表1 提取方法比较mg/kg

表2 加标回收率

由表2可知，六种组分回收率为92.9%～98.7%，可见此提取方法简单，效果比较理想，且对每个组分的重复测定相对标准偏差RSD值在1%以内。

2.6 检出限 经测定，六种水溶性维生素的检出限分别为烟酸4 mg/kg、烟酰胺5 mg/kg、维生素B610 mg/kg、叶酸 5 mg/kg、维生素 B110 mg/kg、维生素B25 mg/kg。

2.7 流动相的选择 梁琳等（2016）的研究中，用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾作流动相，而本次试验用磷酸氢二钾：乙腈作流动相，但几个组分出峰不理想，叶酸、维生素B1无法检出；而依据国标及符金华等（2017）的研究，换为庚烷磺酸钠-EDTA：甲醇后各组分分离能够满足要求，且91∶9的比例时维生素B和维生素B2能够完全分离，而总出峰时间最短。

3 结论

该法以庚烷磺酸钠-EDTA为离子对，加甲醇（V∶V=91∶9）配制流动相，柱温35℃， 流速0.65 mL/min，以酸性EDTA提取液90℃水浴提取，实验操作简单，提取方便，因流动相采用固定流速、固定体积比，方法基线稳定，重复性理想，相对标准偏差＜1%，线性关系良好，相关系数在0.9996以上，六种组分分离理想，回收率高，均在92%以上，完全能够满足检测需求。所以本方法作为同步测定预混合饲料中六种水溶性维生素（烟酸、烟酰胺、维生素 B6、叶酸、维生素 B1、维生素 B2）是一种理想的检测手段。