高效液相色谱法测定饲料添加剂D-生物素的含量

裘丞军，任玉琴

（浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州311199）

D-生物素即生物素，又称维生素H，辅酶R，属于水溶性B族维生素，广泛存在于动植物组织内。其主要作为体内多种羧化酶的辅酶，参与二氧化碳的转移固定和羧化反应，促进糖类、脂肪和蛋白质代谢。D-生物素已被收录于中华人民共和国农业部公告 第2045号《饲料添加剂品种目录（2013）》，大量应用于生物医药、食品化妆中，在畜禽养殖应用中有促进动物正常生长，提高饲料转化率等重要作用（陈宏等，2008）。目前食品和饲料中生物素含量的测定方法，有微生物测定法（国家标准，GB 5413.19-2010）、荧光免疫层析法（刘海英，2016）、酶联免疫法（徐幼平等，2000）、分光光度法 （国家标准，GB/T 17778-2005）、高效液相色谱法（潘一斌等，2009；余林梁等，2003）、高效液相色谱-串联质谱法 （刘进玺等，2010）。其中微生物法、荧光免疫层析法和酶联免疫法操作繁琐，试剂昂贵，对检测技术要求比较高，主要是针对检测D-生物素含量较低的样本；分光光度法操作步骤多，时间长；液质联用法对仪器的要求比较高；而液相色谱法适用范围大，应用比较广泛。目前，D-生物素原料的分析方法主要有酸碱滴定法（欧洲药典8.0版，2014：1671-1672； 日本药典 16 版，2011：458-459）、高效液相色谱法 （美国药典 36版，2013：2664-2665），国内饲料行业尚无国家标准。本研究为进一步优化相关条件建立高效液相色谱法，测定不同来源和批次的生物素原料含量，并与酸碱滴定法进行了对比研究，结果确定该方法简便、快速、灵敏、准确、专属性好，可以作为生物素饲料原料的质量控制方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 生物素标准品 （中国食品药品检定研究院）；一水合高氯酸钠（分析纯）；磷酸（分析纯）；三氟乙酸（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；水（超纯水）；酚酞指示剂；0.1 mol/L NaOH标准滴定液。

饲料添加剂D-生物素样品由四家企业提供（ 批 号 ：141102、VH20150328、CS1-1502019、KXVHUSP150901）。

Agilent1260高效液相色谱仪，紫外检测器（美国Agilent公司）；KQ-500E超声仪（昆山超声仪器公司）；ZP205电子天平（Mettler公司）。

1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent XDB-C18柱，柱长 150 mm，内径 4.6 mm，粒径 5μm；流动相：乙腈+缓冲液（含0.1%高氯酸钠和0.1%磷酸的水溶液）=8.5+91.5（体积比）。 流速：1.2 mL/min；进样量：20 μL；紫外检测波长：210 nm。

1.3 标准溶液配制 准确称取生物素标准品40 mg（精确至0.01 mg），置于200 mL容量瓶中，加入提取液（乙腈+水=1+4）约 150 mL，50℃水浴超声波助溶5 min，冷却至室温，用提取液定容至刻度，混匀。

1.4 饲料添加剂样品前处理 准确称取饲料添加剂试样 40 mg（精确至 0.01 mg），置于 200 mL容量瓶中，加入提取液（乙腈+水=1+4）约150 mL，50℃水浴超声波助溶5 min，冷却至室温，用提取液定容至刻度，混匀。

2 结果与分析

2.1 方法线性和检测限试验 取适量标准品溶解稀释成 25、50、100、200、400 μg/mL 系列浓度的溶液，取20μL注入液相色谱测定分析，记录生物素峰面积，以浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制线性回归曲线。结果表明生物素在25～400μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，y=7.46044x+4.06379（r=1.00000)，方法检测限为1.5 mg/kg，满足检测要求。标准品色谱图见图1。

2.2 精密度试验 取四批次样品 （批号141102、VH20150328、CS1-1502019、KXVHUSP150901）各5份，按试验方法1.4处理，取20μL样品溶液注入液相色谱测定分析，外标法计算含量，结果如表2， 平均含量分别为 100.4%、99.3%、99.9%、95.9%，RSD（n=5）为 0.1%、0.2%、0.1%、0.2%，表明精密度良好。

2.3 准确度试验 取生物素标准品约30、40、50 mg各3份（精确至0.01 mg），按试验方法1.4处理，取20μL样品溶液注入液相色谱测定分析，外标法计算含量，并计算回收率，结果见表1。

图1 HPLC色谱图

2.4 与酸碱滴定法测定含量的比较 参照美国药典36版 （2013：2664-2665） 测定生物素的方法，称取四批次样品（批号CS1-1502019、141102、VH20150328、KXVHUSP150901）各 5 份，每份约500 mg（精确到0.1 mg），置于 250 mL锥形瓶中，加水100 mL。加热搅拌溶解，加酚酞指示剂2滴，用0.1 mol/L NaOH标准滴定液缓慢滴定至粉红色，且保持30秒不褪色，每毫升0.1 mol/L NaOH标准滴定液相当于24.43 mg的生物素。计算样品含量和RSD，结果如表2，试样1与试样2两种方法含量测定结果基本一致，试样3和试样4用本方法测定的结果较酸碱滴定法低。进一步分析试样溶液色谱图，发现试样1和2色谱图基线干净无杂峰，而试样3和4主峰后有杂质峰出现，并呈完全的基线分离，表明酸碱滴定法定量没有专属性，准确度较低，而本方法分离效果好，准确度高。另外RSD数据表明本方法的精密度比酸碱滴定法相对更高，所以确定本方法定量更加准确合理。

表1 回收率试验结果（n=9）

表2 两种含量测定方法结果比较

2.5 溶液放置稳定性 取样品 （批号KXVHUSP150901）按试验方法1.4处理，在室温分别放置 0、25、50、100、150、250 min 后测定，记录峰面积，显示峰面积分别为1472、1469、1472、1470、1473、1472 （单位 mAU*s）；RSD=0.1%（n=6）。结果表明样品溶液在考察的时间范围内有很好的稳定性。

2.6 专属性 取样品（批号CS1-1502019）约20 mg（共5份），其中三份分别加5 mL 1 mol/L盐酸溶液、5 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液、5 mL 30%双氧水，放置18 h，进行酸破坏、碱破坏、氧化破坏，pH调至中性后用提取液稀释至100 mL；另两份直接用提取剂稀释后，一份在254、365 nm紫外波长光照24 h，一份不做任何处理作为对照。结果表明样品对酸、碱和光照均较稳定，对于氧化破坏较明显，产生的氧化破坏产物在该色谱条件下完全分离无干扰。色谱图见图2。

图2 试样破坏试验处理后色谱图

2.7 耐用性 取样品（批号KXVHUSP150901）按试验方法处理，在该色谱条件下通过改变色谱柱型号规格、流动相比例以及色谱仪器型号考察，结果表明色谱系统耐用性良好。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

3.1.1 波长选择 生物素在紫外波长光区内没有特征吸收峰波长，在190～235 nm波长处吸光度由高到低。试验中选取乙腈/0.05%三氟乙酸溶液=15/85、乙腈/水=1/4、乙腈/0.1%高氯酸钠和 0.1%磷酸溶液=8.5/91.5三种溶媒，取4批次试样，每批试样3份用相应的溶媒溶解稀释成浓度约为40μg/mL的溶液，用200、210 nm两个检测波长，进行5次重复检测，结果见表3。在乙腈/水作为溶媒时，210 nm吸光度更稳定。因此检测波长确定为210 nm。

表3 两种波长和三种溶媒吸光度稳定性比较（n=5）

3.1.2 流动相组成 生物素的化学结构是咪唑酮环与噻吩环相结合的骈环，带有一个戊酸侧链，呈弱酸性。在中性和碱性溶液环境中部分或全部以离子形态存在，有较强极性，在C18色谱柱上几乎不保留，但是在弱酸环境中生物素以分子形态存在，极性减弱，在C18色谱柱上保留时间长。因此选择带弱酸性的溶液作为流动相，并且选用在短波长处吸收小的乙腈体系作为流动相。试验参考美国药典 36版（2013：2664-2665）选取乙腈磷酸高氯酸钠缓冲液体系 （乙腈/0.1%高氯酸钠和0.1%磷酸溶液=8.5/91.5）、参考欧洲药典8.0版（2014：1671-1672）选取乙腈三氟乙酸溶液体系（乙腈/0.05%三氟乙酸溶液=15/85），用25%乙腈水溶解稀释试样至200μg/mL的溶液测试对比分析，并对试剂空白进行色谱分析，结果见表4。生物素在乙腈磷酸高氯酸钠缓冲液体系中理论塔板数高，对称因子大，分离度高，保留时间合理，基线噪音小（见图1），更适合作为流动相。

表4 两种流动相体系比较

3.2 溶解方法的确定 生物素在稀碱中溶解，在水中极微溶，在50℃水中微溶，在乙腈中几乎不溶，而本方法色谱条件是弱酸性环境，不能用稀碱溶解。结合3.1.1波长选择试验，生物素用乙腈水溶液作为溶媒时，吸光度更稳定，因此试验中精密称取5份试样（批号KXVHUSP150901），选取用乙腈/水=1/4作为提取剂，分别直接振摇5 min或者50℃水浴超声助溶 5、10、20、30 min进行考察分析，测得样品浓度，结果表明水浴超声5 min就能够有效溶解试样。

4 结论

本文对高效液相色谱法测定饲料添加剂生物素原料的含量进行优化研究，并进一步和酸碱滴定法进行比较，结果表明，酸碱滴定法需人为判断滴定终点，存在个体差异，专属性也不强，精密度和准确度相对较差；而本方法选用较为稳定的210 nm为检测波长，乙腈高氯酸钠磷酸缓冲液作为流动相，保留时间合理，基线稳定，噪音小，操作简单，样品直接溶解后使用高效液相色谱仪外标法定量，人为误差减少，并且杂质分离效果好，专属性强，相对酸碱滴定法有较好的精密度和准确度，非常适用于生物素原料的质量控制。