蚕沙中果胶的提取工艺及其抗氧化活性研究

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(1. 安徽新华学院药学院，安徽合肥 230088；2. 安徽农业大学，安徽合肥 230036； 3. 安徽中医药大学中西医结合学院；安徽省中医药科学院中西医结合研究所，安徽合肥 230012)

0 引 言

蚕沙，别名蚕矢，是蚕蛾科家蚕属昆虫家蚕幼虫的干燥粪便，是一种传统的中药材[1]，其入药历史悠久，始载于《名医别录》中，《本草纲目》记载：“治消渴，癥结，及妇人血崩，头风，风赤眼，去风除湿。”蚕沙性味辛、温，归肝、脾经，具有祛风除湿、和胃化浊、活血通络等功效，现代药理学研究表明，蚕沙具有降血脂、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抑菌、消炎、抗病毒等活性。原因在于蚕沙中含有多种化学成分，如：叶绿素、果胶、叶酸、生物碱等[7]。其中，蚕沙果胶在防治冠心病、动脉硬化、高血脂等心血管疾病方面的作用越来越引起人们的重视[8]，然而关于蚕沙中提取的果胶进行抗氧化研究较少，因此，实验采用正交设计法优化蚕沙果胶的提取工艺，通过化学抗氧化法对其体外抗氧化活性进行评价，为其进一步研究开发和应用，拓展其在食品工业的应用提供实验依据。

1 仪器与试剂

1)仪器：紫外可见分光光度计TU-1810：北京普析通用仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9101-3A：上海三发科学仪器有限公司；电子天平FA2004：上海越平科学仪器有限公司。

2)试剂：蚕沙：购自于安徽中医药大学第一附属医院，经安徽新华学院生药学教师许燕老师鉴定合格，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 蚕沙中果胶的含量测定及提取工艺确定

2.1.1 对照品储备液制备：

精密称取20 mg干燥至恒重的无水葡萄糖对照品，置于100 mL的容量瓶中，先加适量水完全溶解后，继续加水定容至相应刻度，摇匀，即得浓度为0.2 mg/mL葡萄糖对照品储备液，备用。

2.1.2 样品溶液配制：

取20 g风干的蚕沙，加少量水浸泡后除去其中的泥沙等杂质，加入200 mL水，加热煮至微沸灭酶，3 min，按一定的料液比例加入配置好的0.6 %稀硫酸溶液，温度控制在70 ℃，回流冷凝提取，抽滤后浓缩，加乙醇溶液，静置24 h，抽滤得到果胶固体，70 ℃下干燥至恒重。精密称取果胶成品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加适量水溶解后，定容至相应刻度，摇匀后，即得蚕沙果胶样品溶液[9]。

2.1.3 标准曲线建立：

精确吸取葡萄糖对照品溶液2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加水定容至相应刻度后，摇匀，得系列标准溶液。取2.0mL系列标准液置于不同试管中，量取蒸馏水2.0 mL作为空白对照，分别加入1 mL已配制的5 %苯酚溶液，摇匀后迅速加入5 mL浓硫酸，立即摇匀，于40 ℃水浴中保温，30 min后取出，放于冷水浴中5 min，使其降至室温。以2.0 mL蒸馏水所得空白溶液作为参比，490 nm波长处测定葡萄糖标准液的吸光度，以吸光度(A)对浓度(C)进行线性回归，得线性回归方程为：A= 0.024C+ 0.041 (r2=0.9966)。结果表明，葡萄糖在4.0-20.0 μg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系。

2.1.4 方法学考察:

取线性范围内的浓度，按“2.1.3”项下处理，分别对精密度、稳定性、重复性、加样回收率进行考察，结果显示样品的稳定性良好，RSD(%)<5 %，加样回收率>95 %，表明本实验方法稳定可靠。

2.1.5 正交试验[10]：

在前期预试验基础上，以提取次数A、提取时间B、料液比C为影响因素确定正交试验方案，以浸出物和多糖提取量的综合评分为指标，设定综合评分总分为10分，浸出物提取量和多糖提取量的权重系数均为5，因素与水平见表 1，正交试验结果见表 2。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

图1 VC和蚕沙果胶还原力的比较

F0. 05(2,2) = 19.00;F0.01(2,2)=99.00

由表2和表3得出，蚕沙果胶提取量影响因素大小为A>B>C，即提取次数>提取时间>料液比，故最佳提取工艺为A2B3C2，即提取次数为2次 ，提取时间为100 min，料液比为1∶20。

表3 方差分析表

2.1.6 验证试验：

按最佳工艺条件进行验证性试验，得平均浸出物和多糖的提取量分别为108.59 mg/g和111.24 mg/g。

2.2 蚕沙果胶抗氧化活性研究[11]

2.2.1 抗氧化活性的测定

2.2.1.1 还原能力测定：

按照“2.1.2”项下最优提取工艺制备的蚕沙果胶固体配制成不同浓度溶液各1 mL、0.2 mol/L PBS(pH=6.6)2.5 mL、1 %的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL分别加入到同等规格的试管中，混合摇匀后在50 ℃的水浴中保温，20 min后，迅速冷却至室温，移取2.5 mL的10 %三氯乙酸溶液加入试管中，混匀，3000 r/min离心10 min，取上层清液2.5 mL，加入2.5 mL的蒸馏水和0.5 mL的0.1 %三氯化铁溶液，充分摇匀后，静置10 min，以蒸馏水作为空白对照，于700 nm处测待测品的吸光度值，见图1。

图1表示不同浓度蚕沙果胶的还原力，可以看出随着浓度的增高，蚕沙果胶的还原力不断增高，在低于0.06 mg/mL时，还原力略优于VC，但当大于0.06 mg/mL时VC的还原力优于蚕沙果胶。

2.2.1.2 ·OH清除能力的测定：

按照“2.1.2”项下最优工艺制备得到的蚕沙果胶固体配制成不同浓度溶液各1 mL、1.8 mmol/L硫酸亚铁溶液2 mL、1.8 mmol/L水杨酸-乙醇1.5 mL分别加入到同等规格的试管中，0.1 mL的0.03 %H2O2溶液启动反应，摇匀后，37 ℃水浴锅中保温，30 min后，以蒸馏水为对照品，于510 nm波长处测定吸光度，平行测定3次，见表4。

表4 蚕沙果胶清除自由基的能力

计算公式(1)：

清除率%=(A对照-A样品)×100%/A对照

(1)

3 结 论

蚕沙果胶的最佳提取工艺为A2B3C2，即提取次数为2次 ，提取时间为100 min，料液比为1∶20。同时蚕沙果胶有一定的还原能力，对羟基自由基的EC50为195.17 μg/mL。

由于蚕沙资源丰富，成本较低，具有一定的抗氧化能力，后期可以进一步开展动物试验的体内研究，为后期开发蚕沙综合利用提供一定的实验基础。