当归四逆汤对大鼠糖尿病周围神经病变的防治作用及对乙二醛酶Ⅰ的影响

周晓晶 李 晶 于江波 王永彬 李 欣 邢日新 明容美 张文风

(长春中医药大学，吉林 长春 130017)

糖尿病周围神经病变(DPN)是最常见的糖尿病并发症，患病率为30%～90%〔1〕。它是一种复杂的进行性神经功能障碍，表现为远端周围神经对称性退化，出现间歇性持久的肢体疼痛和丧失感觉等症状。随着病情的发展，出现糖尿病溃疡和非创伤性截肢〔2〕，据统计临床50%～70%的非创伤性截肢均由其引起，严重影响人们的生活质量。糖基化终末产物(AGEs)即高血糖时产生的非正常糖代谢产物，现已明确其可积聚于周围神经组织，与其受体结合启动下游信号通路干扰正常神经元的功能，从而造成神经损伤〔3〕。文献报道乙二醛酶Ⅰ(GLO1)为AGEs生成的上游开关，可将多余的糖转化为乙二醛(MD)，从而减少AGEs生成〔4〕。临床研究已发现当归四逆汤能有效改善DPN患者主观神经症状，改善膝、跟腱反射及神经传导速度〔5〕。本研究以GLO1为靶点，研究当归四逆汤能否通过调节GLO1含量及活性来防治DPN，进一步明确DPN的发病机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与模型建立 雄性Wistar大鼠40只，体重(240±20)g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK(吉)2016-0003。大鼠随机分笼饲养于无特殊病原菌(SPF)条件下。喂养1 w、禁食12 h，于左下腹腔内注射链脲佐菌素(STZ，50 mg/kg)，72 h后尾静脉取血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠为模型鼠。

1.2分组及给药 造模3 d后将模型鼠随机分为3组，每组10只，即模型组、中药组、西药组。另取10只正常大鼠设为正常组。模型组、正常组大鼠给予生理盐水灌胃；中药组大鼠给予熬制的当归四逆汤7.44 g·kg-1·d-1灌胃，西药组以100 mg·kg-1·d-1氨基双胍灌胃，干预8 w。每天称量体重及监测血糖。

1.3取材及检测指标

1.3.1检测坐骨神经传导速度 给药8 w后，各组大鼠腹腔注射20%乌拉坦(5 ml/kg)麻醉，俯卧固定分离坐骨神经。检测坐骨神经传导速度：利用Medlab生物信号采集处理系统来测定坐骨神经运动传导速度(MCV)和感觉传导速度(SCV)。刺激点位于坐骨结下，记录电极位于离刺激点2 cm处，刺激量从较小开始，逐渐增强到超强刺激。神经传导速度以复合动作电位出现的潜伏期与传导的距离比值来表示。

1.3.2检测坐骨神经形态变化 给药8 w后，分离大鼠双侧坐骨神经，检测坐骨神经形态变化。病理形态检测：坐骨神经放入10%甲醛溶液中固定，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡、石蜡包埋，连续切片，厚度为4 μm，HE染色，进行光镜下病理形态学检测。

1.3.3分光光度法检测坐骨神经GLO1活性 将坐骨神经超声匀浆，匀浆液4℃放置40 min，低温离心10 000 r/min离心15 min，取上清，用Lorry法测上清中蛋白浓度，继而测GLO1活性。

1.3.4荧光定量PCR法检测GLO1 mRNA的表达 提取总RNA，逆转录生成cDNA，利用引物扩增GLO1，以GADPH做内参，引物序列：GAPDH上游引物5′-CCATgTACgTAgCCATCC-3′,下游引物5′-AACCgCTCATTgCCgATAg-3′;GLO1上游引物5′-ATCTTgAACgAACgCCAgAC-3′,下游引物5′-gggATTgCTCCTgATgT-3′。琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。利用2-△△CT值来比较各目的基因的mRNA表达情况。

1.3.5Western印迹法检测GLO1蛋白的表达 于4℃下，利用细胞裂解液匀浆坐骨神经，提取总蛋白。用Lorry法对蛋白进行定量。每孔加入20 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维膜上，加封闭液于室温下封闭2 h，加入兔抗鼠抗体(美国Sigma公司)和GAPDH多克隆抗体，37℃孵育2 h，洗膜后加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)显色。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1当归四逆汤对DPN大鼠体重和血糖的影响 与正常组相比，各组大鼠体重明显减轻(P<0.01)，血糖均明显升高(P<0.01)；与模型组及西药组相比，中药组大鼠体重明显增加、血糖明显降低(P<0.05)。表明当归四逆汤明显改善糖尿病大鼠的体重和血糖，见表1。

表1 各组大鼠体重及血糖变化

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组及西药组比较：2)P<0.05

2.2当归四逆汤对DPN大鼠坐骨神经病理形态的影响 正常组坐骨神经纵切表现为有髓神经纤维排列紧密，髓鞘组织正常，施万细胞散在髓鞘边缘；横切髓鞘内轴突清晰可见。模型组坐骨神经纵切表现为神经纤维肿胀，鞘细胞减少；横切表现为神经外膜毛细血管扩张充血，炎细胞浸润，部分轴突消失。西药组坐骨神经出现部分神经纤维肿胀，鞘细胞数目减少，大部分髓鞘溶解。中药组坐骨神经表现为神经中可见到少数正常髓鞘，鞘细胞数目增多，髓鞘中可见正常轴突。说明当归四逆汤对糖尿病大鼠坐骨神经形态具有明显保护作用，见图1。

2.3当归四逆汤对DPN大鼠坐骨神经传导速度的影响 与模型组相比，各组坐骨神经MCV和SCV都明显升高(P<0.01)，说明当归四逆汤和弥可保都能提高糖尿病大鼠神经传导速度。但西药组神经传导速度与正常组差异有统计学意义(P<0.05)，而中药组与正常组差异无统计学意义(P>0.05)，说明虽然当归四逆汤与弥可保都能提高神经传导速度，但是当归四逆汤的效果更好，神经传导速度接近于正常水平，见表2。

图1 各组坐骨神经病理形态观察(HE，×40)

表2 各组坐骨神经传导速度变化

与模型组比较：1)P<0.01；与正常组比较：2)P<0.05，下表同

2.4当归四逆汤对DPN大鼠坐骨神经中GLO1活性、蛋白表达及mRNA水平的影响 与正常组相比，模型组坐骨神经中的GLO1酶活性、蛋白表达及mRNA水平明显降低(P<0.05)，而中药组均显著增加(P<0.05)；与模型组相比，中药组坐骨神经中的GLO1酶活性、蛋白表达及mRNA水平增加更为明显(P<0.01)，说明当归四逆汤能够增强GLO1活性，上调其蛋白和mRNA表达，见图2，表3。

图2 各组坐骨神经内GLO1蛋白及mRNA水平

表3 各组大鼠坐骨神经内GLO1的变化

3 讨 论

现已公认高糖时造成AGEs积聚，AGEs与其受体RAGE结合启动的下游信号通路在DPN发病中起着关键作用。如果能降低AGEs水平，将会切断后续的信号通路，从而可以阻止周围神经病变。那么如何降低AGEs水平呢？我们还需追溯AGEs产生的原因及过程。如前所述AGEs是高血糖状态下产生的非正常糖代谢产物，产生主要有两条途径，其中重要的产生途径为通过高糖产生的活性二羰基如3-脱氧葡萄糖、乙二醛、甲基乙二醛或α-羰基醛与蛋白质、脂质和核酸结合而成的〔6〕。要控制AGEs的生成需切断此途径，减少活性二羰基或α-羰基醛生成AGEs的机会。基于此我们可以把目光集中于乙二醛酶系统，该酶系统包括GLO1和GLO2，可将有糖化活性的活性二羰基和α-羰基醛催化生成相应的无糖化活性的酸，减少AGEs的生成〔7，8〕。其中GLO1是α-羰基醛代谢系统的限速酶，能防止活性二羰基在细胞内的堆积进而产生AGEs，被认为是防止AGEs形成的关键酶〔4〕，因此提高GLO1含量及活性可减少AGEs的生成切断AGEs/RAGE信号通路，从而降低由此信号通路导致的DPN。本研究发现当归四逆汤对DPN大鼠的抑制作用或许是通过增强GLO1活性及表达实现的。