两种蛋白酶水解四种蛤蜊蛋白的对比分析

赵欣宇，郭宗明*，赵会，于斌，成华

(1.烟台南山学院 食品系，山东 烟台 265713；2.龙口市南山宾馆，山东 烟台 265700)

随着食品生物技术的发展，传统的水产品加工方式已经越来越不能满足人们的需求[1-3]。利用蛋白酶水解生物蛋白，获得各种氨基酸和功能活性肽，是水产品深加工的一个重要研究方向[4,5]。蛤蜊作为我国重要的贝类水产品，具有低脂肪、高蛋白的营养特点，是研究水解蛋白的良好蛋白质来源[6,7]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花蛤、沙蛤、毛蛤、白蛤：均购于龙口市东城区水产市场。

1.2 试验试剂

精制中性蛋白酶(酶活力20万U/g)：产自南宁庞博生物工程有限公司；复合风味蛋白酶(酶活力5万U/g)：产自南宁东恒华道生物科技有限公司；其他化学试剂：均为分析纯。

1.3 试验仪器与设备

DS-1型高速组织捣碎机 上海标本模型厂；TG16G型台式高速离心机 上海精宏试验设备有限公司；HH-2型恒温水浴锅 天津市华北试验仪器有限公司；JB-2A型磁力搅拌器 上海雷磁新泾仪器有限公司；722S型可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；pH SJ-4a型pH计 上海雷磁仪器厂；BC电子天平 上海越平科学仪器有限公司等。

1.4 试验方法

1.4.1 蛤蜊脱壳及匀浆制备方法

为防止加热使蛤肉蛋白产生热变性，影响试验结果，本试验采用物理方法对蛤蜊进行脱壳处理。将蛤蜊洗净，使用铁钳将其外壳剥落，得到完整蛤肉[8，9]。将处理得到的蛤蜊肉，洗净、沥水后放入组织匀浆捣碎机中，充分打浆至均匀，做好标记，按品种分类放入4 ℃冰箱内保存备用。

1.4.2 水解液制备工艺流程

处理后的蛤蜊匀浆→按物料比1∶3加水→加入蛋白酶水解→90 ℃下灭酶5 min →4500 r/min离心10 min→取上清液即为水解液。

1.4.3 单一酶水解试验设计

1.4.3.1 蛋白酶及蛤蜊种类的确定

试验选择精制中性蛋白酶、复合风味蛋白酶在各自适宜的条件下对4种蛤蜊进行水解，以水解结束后的水解度及4种蛤蜊水解液中氨基酸态氮含量和铁含量为评价指标，筛选出水解效果相对较好的酶及相对应的水解度最高的蛤蜊。

1.4.3.2 单一酶水解正交试验设计

为了对单一酶水解试验进行工艺优化，提高水解度，进一步对2种蛋白酶的水解效果进行对比，故而设计了正交试验。

根据单一酶水解试验，分别确定了精制中性蛋白酶和复合风味蛋白酶水解效果最好的蛤蜊，对这2组酶和蛤蜊组合进行水解工艺优化，以水解度为指标，分别得出2个组合的最佳水解工艺条件。选取酶添加量、水解温度、初始pH值、水解时间4个因素作为研究对象，每个因素设置3个试验参数，设计正交试验，试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4.4 复合酶水解试验设计

由于受到蛋白酶水解作用专一性的限制，一种酶只能对几个特定的酶切位点进行水解，水解效果不能达到理想状态。而应用复合酶解技术，能够充分发挥各种酶的互补作用，增强水解效果，使酶解液的水解度更高[10,11]。

1.4.4.1 复合酶混合比例的确定

精制中性蛋白酶和复合风味蛋白酶的水解条件相似，酶切位点又相互补充，可以使2种酶的优势得到最大程度的发挥；为了减少水解时间，将2种酶混合后同时加入匀浆液。2种蛋白酶使用不同添加比例得到复合酶，分别对4种蛤肉匀浆进行水解，研究不同对比例对水解度变化规律的影响。

复合酶解的约束条件为：加酶总量1%，水解温度50 ℃，初始pH值7，水解时间4 h。通过试验探讨精制中性蛋白酶和复合风味蛋白酶的复合酶组合比例分别为4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 8个不同水平，对蛤肉匀浆酶解液的水解度影响差异；同时以单一酶正交试验确定的精制中性蛋白酶和复合风味蛋白酶在最佳工艺条件下蛤肉酶解液的水解度作为对比参照，筛选出2种酶的最佳混合比例。

1.4.4.2 复合酶水解正交试验设计

在加酶总量为1%的条件下，选取复合酶比例、水解温度、初始pH值、水解时间4个因素作为研究对象，每个因素设置3个试验参数，设计正交试验，确定复合酶解的最佳工艺条件，试验因素水平见表2。

表2 正交试验水平因素表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.4.5 测定指标及测定方法

蛤肉中总氮含量的测定：采用微量凯氏定氮法[12,13]。

水解液中氨基酸态氮含量的测定：采用电位滴定法[14]。

水解度的测定：

水解度=水解液中总氨基酸态氮的含量原料中的总氮量×100%。

水解液中铁含量的测定：铁是构成水产动物必不可少的微量矿物质，它不仅对水产动物的生长代谢、营养运输、抗体产生、有机物质合成等各种生理活动产生影响，还对生物体内酶的活性产生影响[15]。测定水解液中铁浓度的变化，能从侧面反映出水解液的水解程度。本试验测定水解液中铁含量采用邻菲罗啉比色法[16]。

2 结果与分析

2.1 4种蛤蜊中总氮与总铁的含量

分别对4种蛤蜊匀浆中的总氮含量和总铁含量进行测定，结果见表3。

表3 4种蛤蜊肉的总氮与总铁含量Table 3 The content of total nitrogen and total iron in four kinds of clam meat

2.2 单一酶水解试验设计

2.2.1 蛋白酶及蛤蜊种类筛选结果

按试验设计进行水解试验，并测定4种水解液中氨基酸态氮含量及铁含量，测量结果见表4。

表4 水解液中氨基酸态氮含量及铁含量Table 4 The content of amino acid nitrogen and iron in hydrolysate

同时，根据试验结果，分别计算出2种蛋白酶水解4种蛤蜊的水解度，并进行对比，结果见图1。

图1 2种蛋白酶水解4种蛤蜊的水解度对比Fig.1 Comparison of hydrolysis degree of four clams hydrolyzed by two proteases

由表4和图1可知，在相同水解条件下，精制中性蛋白酶对毛蛤的水解效果最好，氨基酸态氮含量为0.94 g/dL，水解度达39.00%；复合风味蛋白酶对花蛤的水解效果最好，氨基酸态氮含量为0.70 g/dL，水解度达56.91%。

通过对比2种酶水解4种蛤蜊的水解度发现，复合风味蛋白酶比精制中性蛋白酶的水解效果更好，其中2种酶水解花蛤的水解度差别最大。

2.2.2 单一酶水解条件正交试验结果

因精制中性蛋白酶对毛蛤的水解效果最好，复合风味蛋白酶对花蛤的水解效果最好，故分别对这2组酶及蛤蜊进行正交试验。对精制中性蛋白酶水解毛蛤的工艺条件进行优化，正交试验结果见表5。

表5 精制中性蛋白酶水解毛蛤正交试验结果Table 5 Orthogonal test results of hydrolyzing Scapharcasubcrenata with purified neutral protease

对正交试验结果进行分析，通过极差对比可知，影响水解度的各因素依次为：B>C>A>D；由K值确定最佳工艺条件为A2B1C3D1。对该工艺条件进行验证，结果见表6。

表6 验证性试验结果Table 6 The results of verification test

即影响毛蛤水解度的因素排序为：水解温度>初始pH值>酶添加量>水解时间，精制中性蛋白酶水解毛蛤肉匀浆的最佳条件组合为：酶添加量1.0%，水解温度45 ℃，初始pH 7.5，水解时间3 h，水解度达42.17%。对复合风味蛋白酶水解花蛤的工艺条件进行优化，正交试验结果见表7。

表7 复合风味蛋白酶水解花蛤正交试验结果Table 7 Orthogonal test results of hydrolyzing short necked clam with compound flavour protease

对正交试验结果进行分析，通过极差对比可知，影响水解度的各因素依次为：A>C>B>D；由K值确定最佳工艺组合为A1B3C1D2。对该工艺条件进行验证，结果见表8。

表8 验证性试验结果Table 8 The results of verification test

即影响花蛤水解度的因素排序为：酶添加量>初始pH值>水解温度>水解时间，复合风味蛋白酶水解花蛤的最佳条件组合为：酶添加量0.8%，水解温度55 ℃，初始pH 6.5，水解时间4 h，水解度达63.05%。

由2种酶水解正交试验结果可知，虽经过工艺优化，精制中性蛋白酶对毛蛤的水解度有所提升(由39.00%升至42.17%)，但仍比不上复合风味蛋白酶对其的水解度(52.28%)。总体来说，复合风味蛋白酶对蛤蜊的水解效果更好。

2.3 复合酶水解试验设计

2.3.1 复合酶混合比例的确定

将精制中性蛋白酶和复合风味蛋白酶按照一定质量比例混合，分别对4种蛤蜊进行复合酶水解试验，以水解度大小为依据，确定2种酶的混合比例，试验结果见表9。

表9 不同比例复合酶水解试验结果Table 9 The results of hydrolysis of complex enzyme with different ratios

由表9可知，精制中性蛋白酶与复合风味蛋白酶的混合比例为1∶4时，4种蛤肉匀浆的水解度最高，分别为：花蛤71.49%、沙蛤63.52%、毛蛤67.78%、白蛤69.65%，均高于精制中性蛋白酶和复合风味蛋白酶的单一酶水解的水解度。并且在一定范围内，复合酶水解度随着复合风味蛋白酶添加比例的增加而升高；比较4种蛤蜊匀浆的水解度，复合酶比单一酶的水解效果更好。

2.3.2 复合酶水解正交试验结果

因复合酶在不同添加比例下均对花蛤的水解度最高，故以花蛤为例，进行复合酶水解的正交试验。在加酶总量为1%的前提下，分别为2种酶添加比例、水解温度、初始pH值、水解时间4个因素设置3个试验参数，设计正交试验，以水解度为指标，得出最佳工艺条件，试验结果见表10。

表10 复合酶水解花蛤的正交试验结果Table 10 Orthogonal test results of hydrolyzing short necked clam with complex enzyme

利用复合酶对花蛤进行水解，对正交试验结果进行分析，通过对4个因素的极差对比可知，影响水解度的各因素依次为：A>B>C>D；由K值确定最佳工艺组合为A3B2C2D3。即影响花蛤水解度的因素排序为：2种酶的添加比例>水解温度>初始pH值>水解时间，复合酶水解花蛤的最佳条件组合为：精制中性蛋白酶与复合风味蛋白酶添加比例为1∶4.5，反应温度50 ℃，初始pH 7.0，水解时间5 h，水解度可达73.75%。因此，使用精制中性蛋白酶与复合风味蛋白酶的复合酶水解蛤蜊时，使用该工艺条件，可以提高蛤蜊蛋白的水解效果。

3 结论

由单一酶水解试验结果可知，精制中性蛋白酶对毛蛤的水解效果最好，氨基酸态氮含量为0.94 g/dL，水解度为39.00%；复合风味蛋白酶对花蛤的水解效果最好，氨基酸态氮含量为0.70 g/dL，水解度为56.91%；总体来说，复合风味蛋白酶的水解效果比精制中性蛋白酶要好。

由正交试验结果可知，精制中性蛋白酶水解毛蛤的最佳工艺条件为：酶添加量1%，水解温度45 ℃，初始pH值7.5，水解时间3 h，水解度达42.17%；复合风味蛋白酶水解花蛤的最佳工艺条件为：酶添加量0.8%，水解温度55 ℃，初始pH 6.5，水解时间4 h，水解度达60.42%。经过工艺优化，精制中性蛋白酶对毛蛤的水解度有所提升(由39.00%升至42.17%)，但仍比不上复合风味蛋白酶对其的水解度(52.28%)。进一步确定，复合风味蛋白酶的水解效果要好于精制中性蛋白酶。

由复合酶解试验结果可知，精制中性蛋白酶与复合风味蛋白酶的添加比例为1∶4时，对4种蛤肉的水解度最高，分别为：花蛤71.49%、沙蛤63.52%、毛蛤67.78%、白蛤69.65%；在一定范围内，复合酶水解度随着复合风味蛋白酶添加比例的增加而升高；复合酶水解蛤蜊的最佳工艺条件为：精制中性蛋白酶与复合风味蛋白酶添加比例为1∶4.5，水解温度50 ℃，初始pH 7.0，水解时间5 h，水解度可达73.75%。