环糊精增敏荧光法测定十字花科植物总芥子碱含量

郑 丹， 王文静， 张清峰

(江西农业大学食品科学与工程学院/江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌 330045)

芥子碱是一种季铵盐生物碱(图1)，广泛存在于十字花科植物种子中，如白芥子、黄芥子、莱菔子、油菜籽等，并主要以芥子碱硫氰酸盐的形式存在[1]。现代药理学研究表明，芥子碱具有多种生理活性，可通过扩张支气管平滑肌，起到平喘的作用[2]；能够抑制肿瘤血管的生成，起到抗肿瘤作用[3]；具有抗雄激素活性，起到抑制前列腺增生的作用[4]；芥子碱还具有降压、降血脂、抗辐射、辅助神经元再生等作用[5-8]。

《中国药典》以芥子碱含量评价芥子、莱菔子等中药材的质量，要求芥子中芥子碱含量不低于0.5%，莱菔子中不低于0.4%[9]。目前，芥子碱的测定方法主要是通过高效液相色谱法(HPLC)[10-11]和毛细管电泳法[12]对芥子碱单体分离后再定量。这需要较长的分析时间及较为昂贵的设备和专业的人员操作，并且十字花科植物种子中还含有3-羟基-4-甲氧基桂皮酰胆碱、4-羟基苯甲酰胆碱、3，4-甲氧基苯甲酰胆碱、芥子酸等芥子碱衍生物，这些成分具有相似的生物活性[13]。因此，快速测定芥子中总芥子碱类含量对评价其药材质量也有一定的意义。测定总芥子碱的方法目前有分光光度法[14]和雷氏盐沉淀法等[15]。本试验研究了芥子碱的荧光特性，并利用环糊精空腔包结作用的荧光增强效应，建立芥子碱含量的荧光测定方法，并用于4种十字花科植物种子中的总芥子碱含量的测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与原料 芥子碱硫氰酸盐标准品购自上海同田生物技术股份有限公司；α-环糊精(cyclodextrin，CD)、β-环糊精、γ-环糊精购自江苏丰园生物技术有限公司；莱菔子、黄芥子、白芥子购买于中药店；油菜籽粕购买于菜市场；其他所用试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备 970CRT型荧光分光光度计，购自上海精密科学仪器有限公司；UV-5200PC型紫外可见分光光度计，购自上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芥子碱最佳荧光体系的建立 精确称取芥子碱标准品，用超纯水溶解得到浓度为1.35 mg/mL的标准溶液，放置于4 ℃冰箱备用。(1)pH值的影响试验：准确移取200 μL芥子碱标准溶液于 10 mL 容量瓶中，用不同pH值的磷酸缓冲液(0.2 mol/L)定容至10 mL，充分摇匀放置30 min后，在激发波长350 nm、发射波长470 nm条件下测量荧光强度。(2)CD的影响试验：用pH值为6的磷酸缓冲液(0.2 mol/L)配制浓度为10 mmol/L的α-CD、β-CD、γ-CD溶液。准确移取200 μL芥子碱标准溶液于10 mL容量瓶中，加入不同体积的CD溶液后，用pH值为6的磷酸缓冲液定容，充分摇匀后放置30 min，在激发波长350 nm、发射波长470 nm条件下测量荧光强度。

1.2.2 芥子碱标准曲线的绘制 分别移取0、10、20、30、40、50 μL的芥子碱标准溶液于10 mL容量瓶中，加入7 mL 15 mmol/Lβ-CD溶液(0.2 mol/L磷酸缓冲液配制，pH值为6)和1 mL 60%乙醇，用pH值为6的磷酸盐缓冲溶液定容至 10 mL。充分摇匀后在室温下放置30 min，在激发波长 350 nm、发射波长470 nm条件下测量荧光强度。

1.2.3 十字花科植物中芥子碱的提取与测量 莱菔子、黄芥子、白芥子、油菜籽粕粉碎后过40目筛。准确称取0.25 g样品，加入25 mL 60%乙醇。采用浸提和超声2种提取方式，浸提时间为120 min，超声提取时间为30 min，提取均在常温下进行。提取完成后过滤，取0.2 mL滤液于10 mL容量瓶中，加入0.8 mL 60%乙醇，再加入7 mL 15 mmol/Lβ-CD溶液，用pH值为6的磷酸盐缓冲溶液定容至10 mL。充分摇匀后在室温下放置30 min，在激发波长350 nm、发射波长470 nm 条件下测量荧光强度。根据标准曲线计算芥子碱浓度。

2 结果与分析

2.1 芥子碱的荧光性质

芥子碱在紫外光的激发下可产生荧光，由图2可知，芥子碱的最大激发波长为350 nm，最大发射波长为470 nm。

2.2 环糊精对芥子碱荧光强度的影响

环糊精是一类由D-吡喃型葡萄糖通过α-1，4-糖苷键连接而成的环状低聚糖，其分子形状为上宽下窄中空的环筒状，可与客体分子通过范德华力、疏水作用、空间匹配效应及氢键等相互作用力形成主客体包合物。CD疏水性的空腔微环境可以影响客体分子的理化性质，如改变其紫外-可见吸收、荧光等光谱性质，从而在分析化学上有广泛的应用，可以提高检测的灵敏度和准确性[16]。由图3可知，芥子碱的荧光强度随着α-CD和β-CD浓度的升高而逐渐增强，而γ-CD的影响不明显。并且β-CD会使芥子碱的最大发射波长向短波方向移动，从原来的470 nm蓝移至460 nm。这些现象说明α-CD和β-CD可与芥子碱形成包结物，从而影响其荧光性质。荧光强度的增强可能是因为芥子碱分子进入CD的疏水性空腔，增加了芥子碱的刚性结构，减少了荧光猝灭，从而导致其荧光强度增强[16]。而γ-CD因为空腔尺寸较大，与芥子碱空间匹配程度较差，不形成包结物。

根据芥子碱在470 nm处荧光强度随α-CD和β-CD浓度的变化而变化，二者包结反应的平衡常数K可以由Benesi-Hildebrand方程(公式1)求得[17]：

(1)

式中：F0为无CD时的荧光强度；F为添加不同浓度CD后的荧光强度；[CD]为CD浓度，mol/L；K为二者包结反应的平衡常数，L/mol；[G]为芥子碱浓度，mol/L；Q为包结物荧光量子产率；k为仪器参数。由1/(F-F0)对1/[CD]作图，通过斜率和截距可计算得到平衡常数K。如图3-D所示，回归曲线呈良好的线性关系，说明α-CD、β-CD与芥子碱的包合比为1 ∶1。计算结果列于表1，β-CD与芥子碱的包结平衡常数大于α-CD，说明β-CD与芥子碱包合物更稳定。因为β-CD更廉价易得，且与芥子碱包结更稳定，所以后续试验选用β-CD为荧光增敏剂。

2.3 最佳荧光体系的建立

如图4-A所示，芥子碱荧光强度在pH值为3～6的酸性条件下基本稳定；随着pH值的继续升高，其荧光强度迅速下降。所以，选择pH值为6的磷酸缓冲液进行后续试验。

表1 环糊精与芥子碱包结反应的平衡常数

芥子碱与CD的包结可能需要一定的时间才能稳定，如图4-B所示，芥子碱荧光强度随放置时间的延长迅速下降，25 min后趋于稳定。因此，后续试验中溶液配制混合均匀后，放置30 min再开始测量荧光强度。

在提取十字花科植物中芥子碱时，多用乙醇水溶液为提取溶剂[11，18-19]。因此，在测定实际样品时，要考虑乙醇对芥子碱荧光的影响。如图4-C所示，在10 mL容量瓶中加入不同体积的无水乙醇，因为乙醇会影响溶剂极性，对芥子碱荧光强度影响很大。因此，绘制标准曲线和测定样品时要保证乙醇体积一致。

2.4 荧光法测定芥子碱方法考察

根据“1.2.3”节的方法步骤，测定一系列已知浓度的芥子碱标准溶液的荧光强度，绘制标准曲线。如图5所示，芥子碱的荧光强度与其浓度呈良好的线性关系。当体系中存在β-CD时，同一浓度的芥子碱荧光强度更高，说明β-CD有增敏效果。在空白体系中芥子碱的标准曲线方程为y=5.10x+22.53，r=0.998；添加β-CD后，标准曲线方程为y=5.94x+45.00，r=0.996；式中：y为荧光强度，x为芥子碱浓度，μg/mL。根据斜率比值，β-CD的增敏倍数为1.16倍。连续测定浓度为20 μg/mL的芥子碱标准品6次，计算荧光强度的相对标准差为1.67%，表明方法稳定性很好。

2.5 十字花科植物样品中芥子碱含量测定结果

采用常温浸提和超声辅助提取萝卜籽、黄芥子、白芥子和油菜籽粕中的芥子碱，并利用建立的荧光定量方法进行测定，结果如表2所示。超声辅助提取能有效提高芥子碱的提取效果，可能是因为超声波穿透力强，细胞更易破碎，因此提取效率更高。4种十字花科植物种子中，白芥子中芥子碱含量最高，为14.25 mg/g，其次为油菜籽粕，黄芥子含量最低，原因是十字花科植物种子中还含有3-羟基-4-甲氧基桂皮酰胆碱、4-羟基苯甲酰胆碱、3，4-甲氧基苯甲酰胆碱、芥子酸等芥子碱衍生物，这些化合物结构相似，都会有荧光。因此，本法测定得到的是十字花科植物种子中总芥子碱含量。

表2 十字花科植物样品中芥子碱含量测定结果

芥子碱的紫外吸收光谱在332 nm有最大吸收峰，因此也可以用分光光度法测定。本研究比较了分光光度法和荧光法的测定结果。在332 nm下，芥子碱的标准曲线为y=0.005 86x+0.006 82，r=0.997， 式中：y为吸光度；x为芥子碱浓度，μg/mL。对同一样品的测定结果如表2所示，分光光度法测定的芥子碱含量普遍高于荧光法测定结果，这是因为分光光度法没有选择性，提取液中还含有其他在332 nm下有光吸收的物质。而荧光法具有一定的选择性，因此对于复杂样品，测定结果比分光光度法更准确。

3 结论

芥子碱的最大激发波长和发射波长分别为350、470 nm。α-CD和β-CD可以通过包结作用，增强芥子碱荧光强度。建立了芥子碱荧光定量方法，并用于莱菔子、黄芥子、白芥子和油菜籽等4种十字花科植物种子中的芥子碱含量的测定，结果表明白芥子中芥子碱含量最高，黄芥子最低。