三七总皂苷对大鼠急性重症胰腺炎钙超载中CaMKⅡ-γ表达的影响

董文志 周阳 刘志恒 莫小华

摘要：目的 探討三七总皂苷是否降低胰腺炎大鼠胰腺组织中钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ-γ（CaMKⅡ-γ）基因和蛋白水平的表达，降低细胞钙超载的程度，减轻急性重症胰腺炎时胰腺组织的损伤。方法 雄性SD大鼠120只，随机分为3组：假手术（SO）组、重症急性胰腺炎（SAP）组、三七总皂苷干预（PNS）组。检测3组大鼠的血清淀粉酶（AMS）、细胞内Ca2+浓度、胰腺组织内CaMKⅡ-γmRNA及CaMKⅡ-γ蛋白的表达量、并对大鼠胰腺石蜡切片进行病理评分。结果 SAP组及PNS组在术后4h、8h、12h和24h的血清淀粉酶、胰腺组织CaMKⅡ-γ mRNA的表达量、胰腺组织CaMKⅡ-γ 蛋白表达量、胰腺组织病理评分及胰腺细胞内Ca2+浓度均明显高于SO组（P均<0.05），其中SAP组在术后8h、12h的胰腺组织CaMKⅡ-γ mRNA及CaMKⅡ-γ 蛋白表达量均明显高于PNS组（P均<0.05），SAP组在术后8h、12h、24h的胰腺组织病理评分及胰腺细胞内Ca2+浓度均明显高于PNS组（P均<0.05）。结论 1.CaMKⅡ-γ在大鼠SAP模型中高表达，其与大鼠胰腺炎钙超载的发生有关。2.三七总皂苷可以通过降低CaMKⅡ-γ在胰腺组织内的表达，减轻胰腺细胞钙超载的程度，对胰腺组织起到保护作用。

关键词：SAP;PNS;钙超载;CaMKⅡ-γ

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）09-0067-04

Effect of Panax Notoginseng Saponins on Expression of CaMKII-γin Calcium

Overload in Rats with Acute Severe Pancreatitis

DONG Wen-zhi， ZHOU Yang， LIU Zhi-heng， MO Xiao-hua

（The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650101， China）

【Abstract】Objective： To study whether Panax notoginseng saponins can reduce the expression of calmodulin-dependent protein kinase II-γ（CaMKII-γ） gene and protein in pancreatic tissue of rats with pancreatitis， lower the degree of calcium overload and alleviate the pancreatic tissue damage during acute severe pancreatitis. Methods： 120 SD male rats were randomly divided into 3 groups， sham operation （SO） group， severe acute pancreatitis （SAP） group and Panax notoginseng saponin intervention （PNS） group. The serum amylase （AMS）， intracellular Ca2+ concentration， CaMKII-γ mRNA and CaMKII-γprotein expression in pancreatic tissue were detected in three groups， and their pathological scores were obtained from rat pancreatic paraffin sections. Results： The serum amylase， pancreatic tissue CaMKII-γand mRNA expression， pancreatic tissue CaMKII-γ， protein expression， pancreatic tissue pathological score and pancreatic intracellular Ca at 4h， 8h， 12h and 24h after operation and the concentration of 2+ in SAP group and PNS group were significantly higher than those of SO group （P<0.05）. The expression of CaMKII-γ mRNA and CaMKII-γ protein in pancreatic tissue of SAP group were significantly higher than that of PNS group at 8h and 12h after operation （P<0.05）， the pathological scores of pancreatic tissue and the concentration of Ca2+ in pancreatic cells in the SAP group were significantly higher than those in the PNS group at 8h， 12h and 24h after operation （P<0.05）. Conclusion： A. CaMKII-γ is highly expressed in rat SAP model， which is related to the occurrence of calcium overload in rat pancreatitis. B. Panax notoginseng saponins can reduce the degree of calcium overload in pancreatic cells by reducing the expression of CaMKII-γ in pancreatic tissue and protect pancreatic tissue.

【Key words】 SAP， PNS， calcium overload， CaMKII-γ

随着学者们对SAP研究的不断深入，发现胰腺腺泡“钙超载”是 SAP 发生发展过程中非常重要的环节，通过阻断“钙超载”，可延缓SAP病情的发展[1]。有学者发现CaMKⅡ-γ是细胞内调节Ca2+的重要调控蛋白，对细胞膜上的钙通道以及细胞内钙库膜上的相关钙通道的调节都起着重要作用[2]。本实验是想通过建立大鼠SAP模型，三七总皂苷腹腔注射，检测大鼠的血清淀粉酶、细胞内Ca2+浓度、胰腺组织内CaMKⅡ-γmRNA及CaMKⅡ-γ蛋白的表达量、并对大鼠胰腺石蜡切片进行病理评分。以寻求SAP钙超载的发生机制和三七总皂苷对钙超载改善作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康成年清洁级SD雄性大鼠120只，体重200～250 g，120只SD大鼠随机分成3组：①假手术组（SO组，n=40）;②重症急性胰腺炎组（SAP组，n=40）;③三七总皂苷介入组（PNS组，n=40）。分别于术后4、8、12、24h时，每组随机各选取10只大鼠处死采集标本。

1.2 SO动物模型制备 开腹后仅将十二指肠提出切口，用棉签轻轻翻动胰腺3次，不注射牛磺胆酸钠，消毒棉球及渗出液后，注射生理盐水（0.1 mL/100 g）补液。缝合腹壁各层。

1.3 SAP组动物模型制备 辨认十二指肠降部肠管壁内潜行的胰胆管，用无损伤丝线结扎肝门处胆管，提起十二指肠辨认出十二指肠乳头处，在其对侧肠壁，用预先去尖钝针头1 mL注射器插入肠腔，探查十二指肠乳头，经十二指肠乳头逆行穿刺入胰胆管并向前推进约0.5 cm，使用无损伤血管夹固定针头。以0.2 mL/min的速度向胰胆管内注入5% ST（0.1 mL/100 g），注射完毕后约2～3 min肉眼观察确认大鼠胰腺组织水肿，颜色变为砖红色或灰白色，继续维持针头原位2 min，用消毒棉签吸净腹腔内渗出，解开结扎在肝门部的丝线。注射生理盐水（0.1 mL/100 g）补液。缝合腹壁各层。建立大鼠SAP模型。

1.4 PNS组动物模型制备 在进行胰腺炎模型建模前，行腹腔注射三七总皂苷[50 mg/mL血塞通注射液（0.1 mL/100 g）]。注射后1h，按照SAP组方法建立急性重症胰腺炎模型。成功建立大鼠PNS模型。3组大鼠术后背部皮下注射生理盐水2 mL/kg，以补充术巾丢失水分。清醒后自由饮水，仍然禁食。

1.5 标本采集及指标检测 各实验组于术后按预定时间点从各组随机挑选10只大鼠麻醉后经原切口进腹，观察胰腺炎症及腹水性质，快速采集血液标本和组织标本。心脏采血3-4mL，离心后取上层血清置EP管中-80°C保存，用于检测血清淀粉酶。取全部胰腺组织，25%置于4%多聚甲醛溶液中固定、切片HE染色用于病理组织观察;25%用于CamkII-γ mRNA测定;25%用于CaMKII-γ 蛋白含量测定;25%新鲜标本制备成细胞悬液供细胞内（Ca2+）测定。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件包对数据进行统计学分析，统计结果以P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 SO组、SAP组、PNS组不同时相大鼠血清淀粉酶浓度比较 SAP组及PNS组在术后4h、8h、12h和24h的血清淀粉酶均明显高于SO组（P均<0.05），SAP组在术后各时间点的血清淀粉酶与PNS组相比差异均无统计学意义（P均≥0.05）。见表1。

2.2 SO组、SAP组、PNS组不同时相大鼠胰腺组织CaMKⅡ-γ mRNA表达水平的比较 SAP组及PNS组在术后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺组织CaMKⅡ-γ mRNA的表达量均明显高于SO组（P均<0.05），其中SAP组在术后8 h、12 h的胰腺组织CaMKⅡ-γ mRNA均明显高于PNS组（P均<0.05），在术后4 h、24 h的胰腺组织CaMKⅡ-γ mRNA与PNS组相比差异均无统计学意义（P均≥0.05）。见表2。

2.3 SO组、SAP组、PNS组不同时相大鼠胰腺组织CaMKⅡ-γ 蛋白表达水平的比较 SAP组及PNS组在术后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺组织CaMKⅡ-γ 蛋白的表达量均明显高于SO组（P均<0.05），其中SAP组在术后8 h、12 h的胰腺组织CaMKⅡ-γ 蛋白均明顯高于PNS组（P均<0.05），在术后4 h、24 h的胰腺组织CaMKⅡ-γ 蛋白与PNS组相比差异均无统计学意义（P均≥0.05）。见表3。

2.4 SO组、SAP组、PNS组不同时相胰腺细胞内Ca2+浓度的比较 将转染了荧光显色剂的胰腺组织碎片，放在载玻片上，使用盖玻片轻压胰腺组织。使用荧光显微镜下观察，可见胰腺腺泡细胞内钙离子的显影，呈现绿光（见图1、图2）。通过细胞内Ca2+的荧光强度（FI）来反映细胞内Ca2+的浓度大小。SAP组及PNS组在术后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺细胞内Ca2+浓度均明显高于SO组（P均<0.05），其中SAP组在术后8 h、12 h、24 h的胰腺细胞内Ca2+浓度均明显高于PNS组（P均<0.05），在术后4 h的胰腺细胞内Ca2+浓度与PNS组相比差异均无统计学意义（P均≥0.05）。见表4。

2.5 SO组、SAP组、PNS组不同时相胰腺组织病理损伤评分的比较 SAP组及PNS组在术后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺组织病理损伤评分均明显高于SO组（P均<0.05），其中SAP组在术后8 h、12 h、24 h的胰腺组织病理损伤评分均明显高于PNS组（P均<0.05），在术后4h的胰腺组织病理损伤评分与PNS组相比差异均无统计学意义（P均≥0.05）。见表5。

表1 各组血清淀粉酶（AMS）水平的比较（x±s，U/L）

注：与SO组比较，*P<0.05

表2 各组大鼠胰腺组织CaMKⅡ-γ mRNA表达水平的比较（x±s）

注：与SO组比较，*P<0.05;与SAP组比较，△P<0.05

表3 各组大鼠胰腺组织CaMKⅡ-γ 蛋白表达水平的比较（x±s）

注：与SO组比较，*P<0.05;与SAP组比较，△P<0.05

表4 各组大鼠胰腺胰腺细胞内Ca2+荧光强度的比较（x±s）

注：与SO组比较，*P<0.05;与SAP组比较，△P<0.05

表5 各组大鼠胰腺胰腺组织病理损伤评分的比较（x±s）

注：与SO组比较，*P<0.05;与SAP组比较，△P<0.05

图1 在普通显微镜下胰腺组织的形态

图2 在荧光显微镜下组织内Ca2+呈现绿色

3 讨论

急性胰腺炎为外科常见的急腹症之一，其患者中的20%-30%为SAP患者，SAP病情发展凶险，死亡率较高。导致SAP治疗难度大的原因之一是其发病机制复杂多样，对其机制的研究也还不够透彻。因而其发病机制的研究一直是学者们研究的重中之重。自“胰腺腺泡细胞钙超载学说”被提出以来，钙超载学说一直成为研究的热点，并且有学者认为，胰腺腺泡“钙超载”在 SAP 发病机制中占有中心地位[3]。

Ca2+是胰腺腺泡细胞进行生理活动的主要离子。在静息状态下，胰腺腺泡细胞内Ca2+稳定在150mmL/L水平左右，刺激状态下Ca2+呈波动性变化。细胞Ca2+主要存储在内质网，在胰腺腺泡细胞中的浓度与分泌颗粒在细胞中的分布一致。胰腺腺泡细胞内Ca2+反应可分为生理性和病理性两种明显不同反应。

生理状态下胰腺腺泡细胞内钙信号会发生小幅度的振荡，主要受神经性递质乙酰胆碱（ACh）和循环激素缩胆囊素（CCK）激发。乙酰胆碱和缩胆囊素的受体位于腺泡细胞的基底区质膜上[4-5]，它们接受刺激产生第二信使并触发细胞内钙库释放钙离子。小幅度的细胞内钙信号振荡和全细胞钙信号振荡波是生理性的钙信号。但是过量的乙酰胆碱和缩胆囊素以及甲萘醌（氧化应激诱导剂）能引起全细胞钙离子超载，这最终能导致细胞死亡。病理状态下，胰腺腺泡细胞内内质网膜上钙释放通道Ryanodine受体和质膜SOCs通道开放，引起细胞外钙离子顺化学梯度大量内流，同时伴有细胞ATP耗竭及生物膜的损伤，二者皆可影响钙-镁ATP酶活性，导致升高的钙离子不能有效重吸收或泵出细胞外，不仅影响细胞正常分泌功能导致胰酶大量分泌造成胰腺组织“自我消化”，甚至导致胰酶在胞内的过早激活，最终导致SAP的发病。

钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）存在于体内所有重要器官中。它主要存在于神经组织，其中大脑中含量高，总蛋白含量的1%，其中在突触后致密带占神经总蛋白含量的20%～30% 。胰岛中含量很高，它也较多地存在于垂体前叶细胞和平滑肌细胞[6]。CaMKⅡ在细胞中的主要作用是调节器Ca2+的代谢。但是其在不同的组织中，以不同形式存在，发挥不同作用。

钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一种多功能蛋白激酶，存在于体内所有重要器官中，纯化的CaMKⅡ几乎无活性，其与钙/钙调素结合后，自身要通过两条途径实现对Ca2+的调节：①作用于胞膜L型钙通道，磷酸化胞膜上的电压依赖性钙通道及其相关调节蛋白，起易化作用，使其开放能力增加，大量钙离子进入细胞[2]。②磷酸化可溶性耐药相关钙结合蛋白（sorcin），去除后者对肌质网上钙释放通道Ryanodine受体（RyR）的抑制，使其开放时间延长，导致肌质网内钙离子释放增加。通过以上途径降低细胞内钙离子浓度，大大避免细胞的钙超载发生。在胰腺外分泌细胞，它可以被钙离子释放激素氨甲酰甲胆碱、胆囊收缩素所激活，但是它不被血管活性肠肽激活。钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ 在胰岛素分泌中起重要作用。在β细胞中它主要是以β3 同工酶的形式存在[7]。CaMKⅡ的多克隆抗体的免疫化学研究发现，胰岛有很强的免疫反应，垂体有中度的免疫反应，肌肉细胞也有适度反应。

在试验中就是将上述的“钙超载”、“CaMKⅡ-γ”以及“三七总皂苷”与“SAP”的发病机制和治疗进行研究。我们使用逆行胰胆管注射法建立大鼠SAP模型，通过检测血清淀粉酶、观察腹水情況、评估胰腺组织变化来明确SAP模型建立成功与否。在SAP发病过程中，我们观察大鼠血清中的Ca2+在相应的时间点出现降低，这和临床工作中人体SAP病情变化相一致，可以推测降低的Ca2+进入细胞内。在检测细胞内Ca2+时，我们使用Fluo-3-am生理学探针，其可以特异标记细胞内Ca2+，探针标记后的胰腺细胞通过流式细胞技术检测Ca2+的荧光强度（FI），使用胰腺细胞内荧光强度（FI）代表细胞内“钙超载”的程度。实验中我们得出：SAP时胰腺细胞发生“钙超载”。在CaMKⅡ-γ的检测，通过基因和蛋白两个水平分别阐述，两个指标进行相互印证，都能说明其在在胰腺细胞中的表达均有细胞“钙超载”的发生有关。在本实验课题中，使用PNS腹腔注射预治疗SAP，对相关指标检测，笔者得出：三七总皂苷可以通过抑制胰腺组织中CaMKⅡ-γ基因和蛋白的表达，减轻细胞内“钙超载”的程度，对胰腺组织进行保护。

综上所述，本次实验通过过建立SAP模型，三七总皂苷腹腔注射，从“胰腺钙超载学说”方面解释了SAP的可能发病机制，并且阐述了三七总皂苷治疗SAP的可能机制，即三七总皂苷可以通过抑制胰腺组织中CaMKⅡ-γ基因和蛋白的表达，从而减轻细胞内“钙超载”的程度，以致达到治疗胰腺炎的作用。相信通过人们更多的研究及努力，对SAP发病机制的研究将会越来越透彻，最终实现预防及更有效治疗重症急性胰腺炎的目标。

參考文献：

[1]薛平，邓力晖，张肇达，等.柴芩承气汤减轻急性胰腺炎大鼠胰腺钙超载的机制研究[M].中国中西医结合杂志，2008;10（6），1054-1058.

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[5]Nathanson MH，Fallon MB，Padfield PJ，et al.Localization of the type 3 inositol 1，4，5-trisp-hosphate receptor in the Ca2+ wave trigger zone of pancreatic acinar cells[J].cells，1993，74（4）：661-668.

[6]Cui ZJ，Gorelick FS，Dannies PS.Calcium/calmodulin-dependent protein kinase-II activation in rat pituitary cells in the presence of thyrotropin-releasing hormone and dopamine[J].Endocrinology，1994，134（5）：2245-2250.

[7]Urquidi V，Ashcroft SJ.A novel pancreatic beta-cell isoform of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II（beta3 isoform）contains a proline rich tandem repeat in the assoc-iation domain[J].FEBS Lett.1995，358（1）：23-26.

（收稿日期：2018-05-15）