杨梅黄酮合氧钒对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

2018-12-04 06:27邹亚丽唐慧安李长江呼丽萍王弋博
天水师范学院学报 2018年5期
关键词:波糖配位糖苷酶

邹亚丽,唐慧安,李长江,呼丽萍,王弋博

(1.天水师范学院 生物工程与技术学院,天水师范学院新型分子材料设计与功能重点实验室,甘肃大樱桃工程技术研究中心,甘肃 天水 741001;2.江西农业大学,江西 南昌 330045)

近20年来,糖尿病发病率迅速上升,以2型糖尿病(T2DM)更甚。[1]临床上T2DM主要用阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇为代表的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物进行治疗,其作用机理是形成酶-抑制剂复合物而使酶失活以阻碍碳水化合物的代谢,控制血糖含量。这类化合物具有一定的副作用,表现为:长期服用阿卡波糖等药物后会产生肠胃胀气,恶心、腹痛、胃疼等肠胃不良症状,还产生肝损害和药物性肝炎等毒副作用。[2-4]近年来研究发现钒化合物能增加机体组织对胰岛素的敏感性,具有抗糖尿病、抗肿瘤及神经保护等多方面功能,且有机钒配合物的降糖效果优于无机钒化合物,[5]但呋喃甲酸类氧钒[6]及氧钒羧酸类配合物也有一定的胃肠道毒副反应,[7]高剂量的钒还可能使钒蓄积在线粒体内,抑制线粒体呼吸功能氧化应激和呼吸抑制导致机体中毒,[8]因此低毒的有机羧酸或有抗糖尿病活性的有机药物为配体的钒配合物,已成为目前钒配合物降糖的热点之一。研究表明黄酮配合物可作为抗氧化剂减轻或消除钒对线粒体的毒性作用,消除钒配合物对细胞连接的破坏,[9-10]本研究基于此采用化学方法合成了杨梅黄酮合氧钒,以紫外光谱、红外光谱等手段对其结构进行了表征,并探究了其对α-葡萄糖苷酶抑制作用和其酶催化动力学特征。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

α-葡萄糖苷酶(美国Sigma公司),阿卡波糖(上海史瑞可生物有限公司);二甲双胍(Sell⁃ick公司),4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,上海叶源生物);3,5-二硝基水杨酸、苯酚、亚硫酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠等药品均为上海生工产品;杨梅黄酮(武汉远城科技发展有限公司),紫外分光光度计(lambda35,PerkinEl⁃mer),傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 6700,Thermo Fisher),酶标仪 (Multiskan FC,Thermo Fisher)

1.2 合成方法

将2.9697g(0.0162mol)V2O5与6.06 mLH2SO4(17.35 mol/L,0.105mol)加入圆底烧瓶,90℃加热并搅拌60min.冷却加少量蒸馏水稀释,加入1.4694g(0.0162mol)H2C2O4,加热并搅拌,反应温度60℃,时间10h,得硫酸氧钒溶液。然后将26.8191g(0.1050mol)Ba(Ac)2配成溶液,边搅拌边滴加到硫酸氧钒溶液中,过滤后将其加热浓缩后置于50℃电热真空干燥箱24h得醋酸氧钒晶体。将0.3182(1mmol)杨梅黄酮与50mL乙醇加入圆底烧瓶,升温至65℃加热并搅拌60min,到杨梅黄酮完全溶解,缓慢滴加50mL含0.1190g(0.5mmol)醋酸氧钒的无水乙醇溶液后,缓慢加入10 mL乙醇钠溶液,65℃回流反应3h,出现褐色沉淀,过滤洗涤,将生成物置于50℃真空干燥箱内干燥24h,得杨梅黄酮合氧钒,其结构式如下:

1.3 结构表征

图1 杨梅黄酮(a)和杨梅黄酮合氧钒配合物(b)结构

配合物采用KBr压片法,在400~4000cm-1范围内炒采集杨梅黄酮及杨梅黄酮合氧钒配合物的红外光谱;取一定量杨梅黄酮及杨梅黄酮合氧钒配合物溶于丙酮中,溶液浓度在10-4mol/L以下,在200~500 nm范围内扫描。

1.4 杨梅黄酮合氧钒对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其催化动力学研究

取20μL 2mg/mL杨梅黄酮合氧钒,加入pNPG(0.116 mol/L)20μL,混匀,37℃水浴恒温60min,反应液中再加入α-葡萄糖苷酶0.1U/mL 50μL,37℃水浴恒温30min,最后加入1mol/L的Na2CO3溶液100μL,终止反应。利用酶标仪在405nm波长下测定OD值。空白组磷酸盐PBS缓冲液(0.2mol/mL,pH6.8)代替酶液,对照组以二甲基亚砜代替样液,阿卡波糖为阳性参照物,根据公式计算各浓度下α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制率。[11]

式中:A为样品的吸光值;A’为样品空白吸光值;A0为对照组吸光值;A0’为对照组空白吸光值。

采用Line weaver-Burk曲线作图法判断杨梅黄酮合氧钒对α-葡萄糖苷酶抑制类型,固定α-葡萄糖苷酶溶液浓度,分别改变pNPG浓度(2.5、5、7.5、10μmol/mL)及杨梅黄酮合氧钒水溶液浓度(0.8、1.2、1.6 mg/m L),以 1/v对 1/[S]作图,得到Lineweaver-Burk曲线(见图6)。[11]

1.5 统计学分析

使用SPSS 20.0软件进行统计分析,实验数据以(X±s)的形式表示,采用LSD法进行数据检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 杨梅黄酮合氧钒结构表征分析

2.1.1 红外光谱分析

杨梅黄酮和杨梅黄酮合氧钒的红外吸收光谱见图2(a)和2(b)。由图2(a)和2(b)可知,二者的红外吸收光谱明显不同,杨梅黄酮在3410cm-1处峰形尖锐,归属为νO-H的伸缩振动,而杨梅黄酮合氧钒在3369cm-1处出现较宽钝的νO-H吸收峰,且强度增加,原因是杨梅黄酮酚羟基与配位水分子形成氢键,使νO-H向低频移动,且强度增加。在515cm-1出现了配位水的振动吸收,进一步佐证了配合物中配位水的存在。杨梅黄酮4号位羰基在1660cm-1处有吸收峰,而杨梅黄酮合氧钒则在1595cm-1处有吸收峰,向低波数移动了65cm-1,表明配体4号位羰基与钒原子配位成键。杨梅黄酮在1200cm-1处出现峰,归属为酚羟基νC-O的伸缩振动,杨梅黄酮合氧钒移至1112cm-1,向低波数移动了88cm-1,原因是杨梅黄酮酚羟基提供电子与钒离子配位;杨梅黄酮合氧钒在614cm-1新出现的峰归属为V-O键的伸缩振动,进一步表明配体与钒阳离子间配位键的形成。

图2 杨梅黄酮(a)和杨梅黄酮合氧钒(b)红外图谱

2.1.2 紫外光谱分析

杨梅黄酮和杨梅黄酮合氧钒紫外光谱见图3(a)和3(b)。杨梅黄酮在200~500nm范围存在两个主要紫外吸收带,最大吸收波长分别为210nm和373nm,而杨梅黄酮氧钒的两个紫外吸收带则均向长波方向移动,最大吸收波长分别为238nm和423nm;分别由210nm移至238nm和由373nm移至423nm,且在357.5nm处出现新峰,这表明杨梅黄酮氧钒对杨梅黄酮B环共轭效应增强较大,对A环的影响相对较小。据红外光谱可知,A环羰基是参与配位的,又从杨梅黄酮的结构式可看出,另一个参与配位的可以是3-羟基,也可以是5-羟基。因3-羟基是与B环共轭,而5-羟基与A环共轭,且杨梅黄酮氧钒配合物对B环共轭效应增强较大,因此可判断是杨梅黄酮的3-羟基而非5-羟基参与配位。

图3 杨梅黄酮(a)和杨梅黄酮合氧钒(b)紫外图谱

2.2 杨梅黄酮合氧钒对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其酶催化动力学特征

由图4所示,随着杨梅黄酮合氧钒浓度的增大,其对a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用也逐渐增强,杨梅黄酮合氧钒浓度为0.4 mg/mL时对a-葡萄糖苷酶的抑制率高,达到91.91%,是同浓度下阳性对照阿卡波糖抑制率的2.45倍,通过计算得到其IC50为271mg/L.

研究表明天然黄酮类活性成分对α-葡萄糖苷酶活性有显著抑制作用,[12-13]本研究发现黄酮类化合物杨梅黄酮合氧钒对α-葡萄糖苷酶的抑制率显著高于阿卡波糖(p<0.005)。刘合生等对比了杨梅素、杨梅苷和氯化矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,发现三者中杨梅苷对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱,杨梅苷疏水性的降低可能减弱了它与酶的亲和力。[14]本研究中合成的杨梅黄酮合氧钒B环3′4′5′携带3个羟基,且是双核黄酮氧钒配合物,由于共轭效应,表现出较强供电性,同时金属配位原子的协同效应,亦增强了杨梅黄酮合氧钒对α-葡萄糖苷酶抑制效果。

图5 杨梅黄酮合氧钒对α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲线

对杨梅黄酮合氧钒抑制α-葡萄糖苷酶作用进行酶动力学分析,Lineweaver-Burk曲线结果表明,当杨梅黄酮合氧钒浓度增加时,抑制作用的表观Km值增大,Vmax不变,说明杨梅黄酮合氧钒对α-葡萄糖苷酶的抑制类型属于典型的竞争性抑制,其竞争性抑制作用的强弱取决于抑制剂与底物竞争酶的浓度,表明杨梅黄酮合氧钒与α-葡萄糖苷酶的底物pNPG有结构上的相似性,能与pNPG竞相争夺α-葡萄糖苷酶分子上的结合位点,从而产生酶活性的可逆的抑制作用,而刘合生等研究发现杨梅苷对α-葡萄糖苷酶的抑制为混合型竞争,可能与杨梅苷3号位碳原子形成鼠李糖苷有关。[14]

3 结 论

本研究合成了新型有机氧钒的配合物杨梅黄酮合氧钒,通过红外光谱、紫外光谱对其进行了结构表征,杨梅黄酮合氧钒可抑制α-葡萄糖苷酶活性,其抑制率达95.60%,其对α-葡萄糖苷酶的抑制类型属于的竞争性抑制,构效关系表明,杨梅黄酮合氧钒A环含有3个游离羟基,且C环3号位羟基具有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,由于含有金属钒可改善胰岛素抵抗,[15]且杨梅黄酮合氧钒能提高钒的溶解性,因此是一种有前景的新型α-葡萄糖苷酶抑制剂。

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