雌二醇对异位子宫内膜腺上皮细胞增殖及BCL6蛋白表达的影响

魏民，徐凌燕，韩婕，徐燕，樊莉莉

(青海省人民医院，西宁810000)

子宫内膜异位症(EMs)是一种雌激素依赖性疾病，雌激素可直接刺激异位内膜细胞增殖、促进新生血管内皮细胞增殖迁移及多种细胞因子的产生，参与EMs的发病过程[1]。EMs异位病灶同样也受到体内雌激素的影响[2]，雌激素诱导的增殖和形态变化最终导致不典型增生，进而可能导致子宫内膜癌[3～5]。最近有研究报道，转录抑制因子BCL6蛋白在EMs患者分泌期异位子宫内膜组织中高表达[6]，且雌激素可通过活化G蛋白偶联雌激素受体(GPER)介导的IL-6/STAT3通路促进乳腺癌细胞SKBR-3增殖[7]。因此，我们推测雌二醇(E2)也可能通过上调异位子宫内膜腺上皮细胞中BCL6蛋白表达促进细胞增殖。2015年6月～2016年1月，我们观察了E2对异位子宫内膜腺上皮细胞增殖及BCL6蛋白表达的影响，以及沉默BCL6蛋白表达对E2诱导细胞增殖的影响，以期揭示E2诱导子宫内膜腺上皮细胞增殖的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 无菌Hank′s缓冲液(HBSS)购自Hyclone公司；胶原酶Ⅳ、MTT购自Sigma公司；Lipofectmine 2000、无菌筛网购自Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清、DMEM/F12培养基、1%青链霉素、胰蛋白酶购自Gibco公司；2 μg/mL氟康唑和BCL6蛋白抗体购自BD公司；17β-雌二醇、RIPA裂解液购自Abcam公司；β-actin抗体购自Santa Cruz公司；BCL6蛋白的小干扰RNA(siRNA)及其对照Scrambeld购自上海吉玛公司，BCL6 siRNA序列上游为5′-CGGCUCAAUAACAUCGUUATT-3′、下游为5′-UAACGAUGUUAUUGAGCCGTT-3′，Scrambeld序列上游为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、下游为5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2 实验方法

1.2.1 异位子宫内膜腺上皮细胞的获取与培养 收集2015年6月～2016年1月青海省人民医院5例卵巢子宫内膜异位囊肿患者的腹腔镜手术切除标本，并经至少2位病理科医生确诊；患者年龄18～45岁，无其他重大内科疾病及激素治疗史。本研究获得医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。将标本迅速运至实验室无菌操作台中，使用无菌HBSS洗3次；无菌剪刀剪碎，用0.03%的胶原酶Ⅳ消化40 min；取出用无菌筛网过滤，将获得的细胞滤液离心并重悬，进行选择性接触来纯化子宫内膜腺上皮细胞。将获得的细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素和2 μg/mL氟康唑的DMEM/F12培养基重悬，并放置在37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养，待细胞达到80%～90%融合度时进行后续实验。

1.2.2 E2对细胞增殖影响观察 采用MTT法。收集异位子宫内膜腺上皮细胞，弃去培养基，置于不含血清的DMEM/F12培养基中孵育12 h。将细胞分为两组，干预组更换为含10 nmol/L的E2的DMEM/F12培养液，对照组更换为不含血清的DMEM/F12培养液。待细胞贴壁后，用MTT法检测24、48、72 h各个时间点的细胞吸光度值，以此表示细胞增殖情况。

1.2.3 E2对细胞BCL6蛋白表达影响观察 采用Western blotting法。取1.2.2中干预组干预0、24、48、72 h的细胞，冷PBS洗2次；RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；经10% SDS-PAGE电泳分离各组样品，转至PVDF膜以5%脱脂牛奶封闭；分别用BCL6蛋白和β-actin抗体孵育，以ECL发光液于曝光仪进行显影；Image J软件分析蛋白条带光密度，以目的蛋白与内参条带光密度比值表示目的蛋白相对表达量。

1.2.4 沉默BCL6蛋白表达对细胞增殖影响观察 将对数生长期细胞1×105个接种24孔板，待细胞贴壁至60%融合度时分为4组。A、B组均采用Lipofectmine 2000染试剂转染BCL6-siRNA，C、D组转染对照Scrambeld；转染后，A、C组均更换为含10 nmol/L的E2的DMEM/F12培养液培养72 h；采用MTT法观察细胞增殖情况，方法同1.2.2。

2 结果

2.1 E2对细胞增殖的影响 见表1。

表1 E2对细胞增殖的影响

注：与对照组同时点比较，*P<0.05。

2.2 E2对细胞BCL6蛋白表达的影响 E2作用0、24、48、72 h时，干扰组细胞BCL6蛋白相对表达量分别为0.17±0.03、0.19±0.02、0.57±0.06、1.14±0.12，48、72 h的BCL6蛋白相对表达量高于0 h时(P均<0.05)。

2.3 沉默BCL6蛋白表达对细胞增殖的影响 见表2。

3 讨论

EMs是性激素依赖性疾病，体内激素水平能够影响该疾病的发生进展[8～10]。研究显示，异位内膜的生长和侵袭是EMs的主要特征，而子宫内膜腺上皮细胞被认为在此过程中起主要作用[11, 12]。近年来研究者认为，EMs患者在位内膜与异位病灶局部雌激素合成增加，促进了在位与异位内膜组织的生长[13]，雌激素水平在EMs中起重要调控作用[1,12, 14]。雌激素能够与子宫内膜腺上皮细胞上的受体特异结合，进而启动一系列分子信号通路，参与EMs的发展[12]。孕激素、雄激素和促性腺激素释放激素类似物等药物可通过减少雌激素产生，抑制子宫内膜细胞的增殖和转移，促进其凋亡，现已与手术切除共同成为临床上最常用治疗手段[15～17]。本研究通过原代分离培养异位子宫内膜腺上皮细胞，并采用10 nmol/L E2进行干预，发现E2可促进异位子宫内膜腺上皮细胞增殖，与先前研究报道结论相一致[12]。然而，目前E2引起子异位宫内膜腺上皮细胞增殖的具体机制尚未完全阐明。

表2 沉默BCL6蛋白表达对细胞增殖的影响

注：与D组同时点比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

BCL6蛋白是转录抑制因子，是B细胞发育和肿瘤发生所必需的[4]。BCL6是人类原癌基因之一，可通过抑制p53和p300等基因表达来促进细胞增殖[5]。最近有研究报道，BCL6蛋白在EMs患者的月经周期分泌期异位组织中高表达[6]；KRAS激活和SIRT1/BCL6过表达有助于EMs发病，并介导孕激素抵抗[5]。因此，我们推测BCL6蛋白表达是否与E2介导异位宫内膜腺上皮细胞增殖有关。本研究采用10 nmol/L E2干预异位宫内膜腺上皮细胞，发现细胞中BCL6蛋白表达上调，表明BCL6蛋白表达水平与局部雌激素水平密切相关。此外，本研究采用siRNA沉默细胞中BCL6蛋白表达，并联合E2刺激细胞，发现BCL6 siRNA逆转了E2对异位子宫内膜腺上皮细胞增殖的促进作用，进一步证实了BCL6在E2刺激诱导异位子宫内膜腺上皮细胞增殖中的作用。

目前，EMs的药物治疗主要是以抑制雌激素合成使异位内膜萎缩、阻断下丘脑卵巢轴的刺激和出血周期为目的的性激素治疗，其仅适用于有慢性盆腔痛、痛经症状明显、有生育要求而无卵巢囊肿形成者，存在依从性差、易复发等问题[12]。本研究发现，E2可能通过调控BCL6蛋白介导异位子宫内膜腺上皮细胞增殖，因此BCL6蛋白可作为治疗子宫内膜异位的新靶标。但是，我们仅研究了E2对BCL6蛋白表达的影响，其上游调控机制以及下游效应途径仍不清楚。今后我们将继续探讨具体上下游机制，以期为EMs的靶向治疗提供新策略。