一例肉牛病毒性腹泻诊断与治疗

杜文炳，冉龙文，张宇，陈凯，杨科花

（江苏省常州市武进区动物检疫站，常州 213165）

0 引言

牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染引起的一种以水样腹泻为主要特征，同时伴随繁殖障碍以及免疫机能障碍为主要特征的一种急性高度接触性传染病[1]。BVD感染可造成免疫抑制和持续性感染，造成机体免疫力低下，极易诱发其他病原的混合感染或者二次感染，是目前影响肉牛养殖的重要疫病之一[2]。广大群众对于牛肉的需求日益增加，肉牛养殖发展迅速。但是由于缺乏相应的管理经验与疫病防控方法，肉牛场BVDV感染引起的腹泻及相关疾病时有发生，严重影响养殖户的经济效益。结合一例典型的BVDV病例，探讨BVDV发病的症状以及治疗要点，同时对BVDV E0蛋白进行进化分析，为我国BVDV防控以及疫苗研发提供参考数据。

1 病例简介

2018年初春，某肉牛养殖场发生顽固性腹泻，病程3～5 d不等。发病早期主要表现为全身症状，病畜精神高度萎靡、食欲不振，有的甚至废绝；大部分病牛表现水样腹泻，呈喷射状，个别粪便中夹杂血液或黏膜组织碎片，渐进性消瘦，部分鼻镜有溃烂面，反刍停止，体温在40 ℃左右。牛场技术人员先期进行抗生素治疗，但是效果不佳，且患畜日益增加。根据临床症状和治疗情况分析，初步诊断为牛病毒性腹泻感染。采集患畜的粪便进行实验室RT-PCR检测。

2 RT-PCR检测

将采集到的BVDV疑似病料用无菌PBS进行1∶3稀释，13 000 rpm离心2 min，取上清使用Trizol进行常规RNA提取，反转录生成cDNA后使用L1：5ˊ-GGTGTGGAGGAACCTGTTTATGATCAG-3ˊ，L2：5ˊ-CCTTTACTATTACCCGACCTGCAGTCACCTC-3ˊ引物进行PCR检测检测。PCR反应体系如下：12.5 μLMix聚合酶，L1和L2引物各1 μL，cDNA 3 μL，无菌双蒸水补足25 μL。PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min后，94 ℃变形30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环。PCR产物预期大小为498 bp。PCR循环结束后取5 μL产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行检测（见图1）。M为DL 2 000 marker，1号泳道为待检病料，2号泳道为阳性对照。在1号泳道出现预期大小的条带，与2号泳道的条带大小一致，判断待检病料为BVDV阳性。

图1 BVDV的PCR检测

3 BVDV E0基因的扩增与分析

采取马文瑞等设计的引物对BVDV E0基因进行扩增。PCR反应体系同2，PCR反应条件为95 ℃预变性5 min后，94 ℃变形30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR循环结束后取5 μL产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。如图2所示，M为DL2 000 marker，1、2泳道为E0基因扩增结果。将目的片段回收，使用宝生物公司的胶回收试剂盒回收目的片段，连接pMD18-T载体，转化JM109感受态细胞于添加有氨苄抗生素的平皿，37 ℃温箱培养12 h，挑取白斑于添加有氨苄抗生素的液体LB培养基中进行培养，送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。研究得到的毒株命名为CH-HENAN。以上所述试验耗材均为宝生物工程大连有限公司产品。M 1 2

图2 BVDV E0基因的扩增

将测序的结果使用DNA star软件进行序列拼接，与Genbank下载的BVDV E0基因序列构建徐彤进化树，如图3所示，CH-HENAN株序列与BVDV亚型的KU756226株、KF835697和MG950357毒株同为BVDV-1b亚型，而与BVDV-1a亚型和BVDV-2亚型的亲缘关系较远。表明目前河南范围内流行的毒株以BVDV-1b亚型为主。

图3 BVDV 系统进化分析

4 讨论与结论

腹泻是影响肉牛生长的重要疫病。由于细菌性腹泻和病毒性腹泻在临床表现十分相似，无法用肉眼进行区分，因此对于疫病的确诊，特别是病毒性腹泻的确诊必须借助实验室诊断方法，以区分牛冠状病毒、牛轮状病毒以及牛病毒性腹泻病毒等病原，进而采取相应的治疗措施。与传统的病毒中和试验和间接免疫荧光方法相比，研究采用的RT-PCR检测方法在分子水平对病原进行鉴定，具有快速、准确等优点。结果与临床症状相互印证，在很大程度上挽回养养殖户的损失。因此，在肉牛饲养中，如果出现顽固性腹泻，抗生素治疗无效，且疫病传播迅速时，需要及时通知当地兽医主管部门采用实验室诊断方法迅速确诊，以及时采取措施，及早控制疫病蔓延。

BVDV根据基因组序列的差异可以分为BVDV-1和BVDV-22个基因型，其中有型又可以分为多个亚型[3]。对BVDV基因分型研究得知地区内病毒遗传进化情况、进化规律以及抗原位点的变化，为疫苗的研发提供有效的参考。研究选择的E0基因是BVDV基因组主要的保护性蛋白基因，结果与近期的相关报道一致[4]。表明BVDV-1b亚型已成为我国牛群BVDV流行的优势基因型，为后续的诊断方法的研发以及疫苗制剂的发展奠定基础。