一次性力竭运动对HIF-1α转基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信号的影响

王林佳，张 缨



一次性力竭运动对HIF-1α转基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信号的影响

王林佳，张 缨

北京体育大学 运动生物化学教研室 北京 100084

目的：探讨一次性力竭运动对HIF-1α转基因鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信号的影响。方法：HIF-1α转基因鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只。随机分为野生安静组（WC组）、野生运动组（WE组）、转基因安静组（HC组）和转基因运动组（HE组）。正式实验时运动组小鼠做递增负荷跑台运动直至力竭，运动后即刻取材，脱颈处死后取两侧小腿骨骼肌。采用酶联免疫法(ELISA)测定骨骼肌Nrf2-ARE结合活性，实时荧光定量PCR测定骨骼肌Nrf2下游抗氧化基因表达，Western Blot法测定骨骼肌中蛋白表达，高质荧光测定法测定小鼠骨骼肌ROS。结果：1）与WC组相比，HC组小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表达显著增加，Nrf2-ARE结合活性显著增加，靶基因SOD1、SOD2、NQO-1 mRNA表达显著增加，NQO-1蛋白表达显著增加，骨骼肌ROS水平极显著下降；2）与HC组相比，HE组小鼠骨骼肌核蛋白Nrf2含量显著性增加，SOD2和NQO-1 mRNA表达量显著增加，且NQO-1蛋白表达显著增加，ROS无明显变化；3）与WE组相比，HE组小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表达显著增加，Nrf2核蛋白及P-Nrf2表达增加。骨骼肌SOD2和NQO-1mRNA表达增加，NQO-1蛋白表达显著增加，骨骼肌ROS含量极显著下降。结论：适当的HIF-1α高表达可提高安静状态下小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的激活，且对一次力竭运动后骨骼肌ROS的消除也有积极的调节作用。

运动；氧化应激；核因子E2相关因子2；低氧诱导因子1-α亚基

低氧训练作为提高运动员运动能力的辅助措施，是运动员经常采用的训练方法之一[21]。运动和环境低氧可刺激机体使之产生适应[6,8]。低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是调节机体缺氧适应的核心转录因子。其功能性亚基HIF-1α发挥主要调节作用，低氧和运动均可促进其表达[4,12]。

核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2，Nrf2）是机体氧化应激中起着中枢调节作用的一个核转录因子[16]。在正常生理状态下，Nrf2与胞浆中的keap1蛋白结合并被固定在胞浆中，当细胞受到氧化应激刺激时，Nrf2与keap1蛋白解离并转移至细胞核，与核内Maf蛋白二聚化后可识别并结合靶基因DNA启动子序列——抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE），促进下游靶基因抗氧化酶基因的转录，如超氧化物歧化酶（SOD）、醌氧化还原酶（NQO-1）、过氧化氢酶（CAT）等一系列抗氧化和Ⅱ相解毒酶。提高机体对抗氧化应激的能力[9,15]。综上所述，Nrf2-ARE系统在机体抗氧化反应中发挥着非常重要作用[9]。

运动、低氧可导致机体内氧化还原平衡破坏[4,15]。目前有研究发现，HIF-1α的高表达可能在机体对低氧适应中起到保护作用，但HIF-1α高表达对力竭运动后小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的影响目前并不清楚。本实验采用野生鼠与HIF-1α转基因鼠，探讨安静状态和一次性力竭运动后小鼠骨骼肌Nrf2-ARE抗氧化信号的变化，进一步揭示HIF-1α和骨骼肌Nrf2抗氧化信号的关系。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

健康8周龄C57BL/6J小鼠20只（W），诱导型HIF-1α转基因鼠20只（H），HIF-1α采用C57BL/6J小鼠制做HIF-1α转基因鼠[22]。所有小鼠均购于中国医学科学院医学实验动物研究所，体重为18±2 g。两种小鼠骨骼肌内HIF-1α蛋白检测结果如图1所示。

图1 小鼠骨骼肌HIF-1α蛋白表达

Figure 1. Expression of HIF-1α Protein in Mice

注：@表示与野生鼠比较＜0.05，下同。

1.2 研究对象分组

HIF-1α转基因鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只。随机分为野生安静组（WC组）、野生运动组（WE组）、转基因安静组（HC组）和转基因运动组（HE组）。实验动物饲养于北京体育大学动物房，分笼饲养，每笼3~4只，温度保持在20~25℃，相对湿度保持在50%~70%，每天进行12 h模拟自然光照射。动物饲养采用国家啮齿类动物标准饲料，整个饲养过程中动物能够自由进食和饮水。

1.3 运动方式

HC组、HE组小鼠均进行一次性递增负荷至力竭跑台运动，坡度为5%，起始速度为10 m/min，每3 min增加1级，直至力竭（表1）。

表1 本研究小鼠递增负荷至力竭的跑台运动方案

Table 1 Exhaustion Exercise Running Scheme of Mice

适应性训练在正式实验开始前两天进行，共进行2天，时间为10 min/天。正式实验时，力竭判断标准为电击10 s仍不运动即视为已达到力竭。

1.4 取材

所有小鼠均采用脱颈处死，运动组小鼠运动后即刻取材，取小腿腓肠肌，用锡纸包裹，标记，投入液氮中。而后，将所有取好的组织存入-80℃冰箱，保存待用。

1.5 实验试剂、仪器及方法

1.5.1 酶联免疫法（ELISA）测定骨骼肌总蛋白Nrf2-ARE结合活性

采用美国Pierce公司生产的蛋白浓度试剂盒，通过BCA方法，测定蛋白匀浆液蛋白浓度。根据测定的蛋白浓度，计算各样品蛋白含量，调整为10 μg所需稀释比例。采用美国Active Motif公司生产的Trans AM Nrf2试剂盒测定Nrf2-ARE结合活性，操作完全按照试剂盒说明书进行。结果以（测定孔OD值－空白孔OD值）/[对照组（测定孔OD－空白孔OD值）平均值]表示。

1.5.2 骨骼肌蛋白提取

将100 mg骨骼肌加入800 μl裂解液A（已加入EDTA）中，匀浆机高速充分匀浆；于冰上静置10 min，涡旋振荡 5 s，再于冰上静置10 min，涡旋振荡5 s，15 000 rpm，4℃离心10 min；取上清即为胞浆蛋白，于-20℃冻存备用。

1.5.3 Western Blot测定骨骼肌蛋白表达

采用美国Pierce公司生产的蛋白浓度试剂盒，BCA法测定骨骼肌的胞浆蛋白及核蛋白浓度。根据测定的核蛋白浓度以及上样蛋白量20 μg计算上样的体积。采用美国life technologies 公司生产的Bolt 4%~12% Bis-Tris Plus凝胶，电泳分离目的蛋白及内参，而后采用美国Invitrogen公司的iBlot2进行转膜。5%的脱脂牛奶封闭1 h，加一抗于4℃孵育过夜。一抗稀释比例为：Nrf2（SC-722，1:200），p-Nrf2（Ser40）（BS-2013R 1:1 000），NQO-1（SC-16464，1:500），SOD1（SC-11407，1:500），SOD2（SC-30080， 1:3 000），CAT（SC-50508，1:500），内参蛋白β-actin（SC-47778，1:1 000），H1（SC-10806，1：1 500）。次日以1×TBST洗3次，每次10 min。加二抗室温孵育1 h，然后1×TBST洗3次，每次10 min。洗膜后，加入发光液（Thermo 34095），曝光结果采用Image Lab软件读取条带积分灰度值，结果用以下公式计算的比值表示。

1.5.4 实时荧光定量测定骨骼肌抗氧化基因mRNA表达量

取小鼠骨骼肌50 mg，沥干，加入0.8 ml Trizol试剂（美国Invitrogen公司），组织研磨、分相、分离、洗涤和提纯总RNA。采用日本Toyobo公司生产的荧光染料反应体系（SYBR Green Realtime PCR Master Mix）及引物Nrf2（QT00095270），SOD1（QT00165039），SOD2（QT00161707），CAT（QT01058106），NQO-1（QT00094357）。采用美国ABI7500荧光定量PCR仪测定SOD1等基因mRNA水平，用该仪器自带软件读取荧光定量CT值。目的基因结果以比较CT法相对定量表示。计算公式为：目的基因=2-△△CT。

1.5.5 荧光比色法测定小鼠骨骼肌ROS含量

采用GENMED高质荧光测定试剂盒测定小鼠骨骼肌ROS含量：取小鼠100 mg的腿部腓肠肌，匀浆，离心后测定蛋白浓度。现配染色液工作液2 000 μl：10 μl染色液+ 190 μl预热的稀释液C，加入190 μl的染色液，37℃水槽孵育20 min，避免光照。荧光分光光度计：激发波长490 nm，散发波长520 nm。

1.6 实验数据统计分析

使用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行处理，使用双因素方差分析处理数据。若有交互作用则采用简单效应检验，若无交互作用则采用独立样本检验。最终实验结果用M±SE表示。＜0.05和＜0.01表示在统计学上有意义，其中，＜0.05表示有显著性差异，＜0.01表示有非常显著性差异。

2 研究结果

2.1 HIF-1α对小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和Nrf2、p-Nrf2、核蛋白Nrf2蛋白表达的影响

如图2所示，HC组与WC组相比，小鼠Nrf 2mRNA和蛋白表达明显增加（＜0.05）。pNrf2和核蛋白Nrf2蛋白表达无明显变化。WE组与WC组相比，小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA显著增加，Nrf2蛋白表达有增加趋势但无显著性，小鼠骨骼肌pNrf2和核蛋白Nrf2蛋白表达无明显变化。HE组与HC组相比，小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表达均无显著性。HE组与WE组相比，小鼠Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著增加（＜0.05），P-Nrf2和核蛋白Nrf2蛋白表达显著增加（＜0.05）。

图2 小鼠骨骼肌Nrf2mRNA表达、Nrf2、p-Nrf2、核蛋白Nrf2蛋白表达

Figure 2. Expression of Nrf2 mRNA and Nrf2/p-Nrf2/ Nuclear Nrf2 Protein in Mice

注：*表示与WC组相比＜0.05，#表示与WE组相比＜0.05，&表示与HC组相比＜0.05，下同。

2.2 HIF-1α对小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性和Nrf2靶基因mRNA表达的影响

如图3所示，HC组与WC相比，小鼠Nrf2-ARE结合活性显著增加，Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2及NQO-1 mRNA表达显著增加。WE组与WC组相比，小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性显著增加，小鼠骨骼肌SOD1、SOD2 mRNA表达显著增加，CAT和NQO-1 mRNA表达量虽有增加趋势但无显著性。HE组与HC组相比，小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性无明显变化。HE组与WE组相比，小鼠Nrf2-ARE结合活性无明显变化，小鼠骨骼肌SOD2和NQO-1 mRNA表达显著增加，SOD1、CAT mRNA表达虽有增加趋势但无显著性。HE组与WE组相比，小鼠SOD1和CAT mRNA表达无明显变化，SOD 2mRNA表达量显著增加，NQO-1 mRNA表达极显著增加。

图3 小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性和Nrf2靶基因表达

Figure 3. Nrf2-ARE Binding Activity and Expression of Nrf2 Target Genes in Mice

2.3 HIF-1α对小鼠骨骼肌抗氧化酶表达的影响

如图4所示，HC组与WC相比，小鼠Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2、CAT、NQO-1蛋白表达无明显变化。WE与WC相比，小鼠骨骼肌SOD1、SOD2、CAT、NQO-1蛋白表达无明显变化。HE组HC组相比，小鼠骨骼肌SOD1、SOD2、CAT、NQO-1均增加，但仅有NQO-1蛋白表达具有显著性增加。HE组与WE组相比，小鼠Nrf2下游靶基因SOD1、SOD2、CAT、NQO-1均出现增加，但仅有NQO-1蛋白表达具有显著性增加。

图4 小鼠骨骼肌抗氧化蛋白表达

Figure 4. Expression of Peroxiredoxins in Mice

2.4 HIF-1α对小鼠骨骼肌ROS水平的影响

由图5可知，HC组小鼠骨骼肌ROS水平极显著低于WC组。WE组与WC组相比，小鼠骨骼肌ROS出现增加趋势但无显著差异。HE组与HC组相比，小鼠骨骼肌ROS无明显变化。HE组小鼠骨骼肌ROS极显著低于WE组。

图5 小鼠骨骼肌ROS水平

Figure 5. The ROS Level in Skeletal of Mice

注：**表示与WC组相比＜0.01，##表示与WE组相比＜0.01。

3 分析讨论

3.1 安静状态HIF-1α高表达对小鼠骨骼肌抗氧化信号影响

目前研究发现，HIF-1α高表达对机体的多个方面都具有调节作用。通过转染使GRC-1细胞HIF-1α高表达，发现细胞内Ca2+的水平会受到HIF-1α的影响。HIF-1α可作用于内质网下调细胞内Ca2+水平，从而避免钙超载[3]。Lunde等[13]对成年大鼠诱导14天使HIF-1α高表达后发现，肌纤维横截面面积增加，氧化酶活性增强和肌凝蛋白增加。然而，HIF-1α高表达对抗氧化系统的影响，目前缺乏文献报道，因此，本研究试图通过对野生鼠和HIF-1α转基因鼠骨骼肌内Nrf2-ARE抗氧化信号通路各指标的对比，探究HIF-1α高表达对抗氧化系统的影响。

在本实验中，安静状态下，HIF-1α高表达小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表达水平明显高于野生鼠。这可能是通过HIF-1α对其下游靶基因的调控来实现。促红细胞生成素（EPO）是位于HIF-1α下游的一种细胞因子，它可以刺激骨髓造血功能，促进红细胞生成。同时，它也被认为是一种具有抗炎和细胞保护作用的抗氧化剂，可以调控Nrf2的激活[5,11,12,17,24]。Genc等[7]研究发现，对人体SH-SY5Y细胞加入EPO孵育24 h后，Nrf2胞浆蛋白和核蛋白表达均升高。这提示，HIF-1α可能可以通过其下游的EPO促使Nrf2表达增加。此外，HIF-1α转基因鼠骨骼肌内Nrf2-ARE结合活性显著高于野生鼠，这可能如文献所述，Nrf2的活化与NF-κB这一炎性转录因子的活化存在着竞争性抑制作用[23]，HO-1不仅是Nrf2的靶基因也是HIF-1α的靶基因。HIF-1α可上调血红素加氧酶（HO-1）表达。而较多的HO-1可抑制NF-κB活化从而促进上游蛋白Nrf2的解离及入核[2]。这也提示，HIF-1α对Nrf2-ARE结合活性的调控可以通过二者共同的靶基因HO-1来实现。

ROS是反映机体氧化应激程度的指标，Nrf2可通过激活其下游抗氧化蛋白的表达来清除机体内过多的ROS。李铁瑛[1]的研究发现，HIF-1α转基因鼠骨骼肌抗氧化蛋白SOD2显著增加，反映氧化应激程度的脂质过氧化物4-HNE蛋白表达量低于野生鼠。本研究中，HIF-1α转基因小鼠Nrf2靶基因mRNA（SOD1、SOD2、NQO-1）及抗氧化蛋白（SOD2、NQO-1）表达量显著升高。与WC组小鼠相比，HIF-1α转基因小鼠骨骼肌ROS水平极显著降低，与上述文献所述结果一致。这表明，HIF-1α的高表达可以使小鼠骨骼肌Nrf2-ARE转录活性提高，抗氧化蛋白表达增多，以及抗氧化能力提高。

3.2 一次性力竭运动对HIF-1α转基因鼠骨骼肌抗氧化信号的影响

HIF-1α是介导机体对低氧适应的重要调节因子。低氧可刺激HIF-1α的表达[18]。而剧烈运动可使体内自由基产生增多，过多的自由基会使机体出现氧化应激进而造成组织损伤[5]。目前有研究发现，在这种运动引起氧化应激中，HIF-1α的高表达可能具有一定的保护作用[20]。适度低氧（10% O2）干预后，PC12细胞HIF-1α蛋白表达增多，细胞总抗氧化能力增强[25]。以上研究表明，HIF-1α的增加对于机体氧化应激状态的调节具有积极作用，但它的增加是否通过Nrf2-ARE信号通路来调节氧化应激状态并不清楚。因此，本实验通过比较野生鼠与HIF-1α转基因鼠一次性力竭运动后骨骼肌内Nrf2 mRNA、蛋白表达、Nrf2-ARE结合活性及下游抗氧化靶基因及抗氧化蛋白表达的变化，来探讨在一次性力竭运动引起的氧化应激中，HIF-1α对机体的调节作用及对Nrf2-ARE信号通路的影响。

在本研究中，HIF-1α转基因小鼠经过一次性力竭运动后骨骼肌Nrf2核蛋白及p-Nrf2蛋白表达显著增加，而野生鼠在运动后并未出现变化。这可能是由于转基因小鼠体内的HIF-1α高表达在安静状态时已经造成了细胞内Nrf2蛋白有较多的累积，大强度的运动造成的氧化应激刺激促进了转基因小鼠骨骼肌内Nrf2的核易位及磷酸化。一次性递增负荷至力竭运动后，本研究中，HE组小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表达明显高于WE组，且下游靶基因SOD2及NQO-1 mRNA表达及NQO-1蛋白表达水平也显著高于WE组。这提示，进行一次性力竭运动时，HIF-1α的高表达可以通过促进小鼠骨骼肌Nrf2 mRNA和蛋白表达，使小鼠在高强度的运动下依然可以保持较高的抗氧化能力，使机体免受氧化应激所造成的损伤。

4 结论

适当的HIF-1α高表达不但可提高安静状态下小鼠骨骼肌Nrf2-ARE通路的激活，而且对一次力竭运动后骨骼肌ROS的消除也有积极的调节作用。

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Effects of Acute Exhaustive Exercise on the Antioxidant Signal of Nrf2 in Skeletal Muscle of HIF-1α Transgenic Mice

WANG Lin-jia , ZHANG Ying

Beijing Sport University, Beijing 100084,China.

To examine the effect of HIF-1α on Nrf2-ARE antioxidant pathway in mice skeletal muscle after acute exhaustion exercise. Methods: HIF-1α high expression (H) and C57BL/6J mice (W) were used at 20 respectively and each kind of mice were randomly divided into two groups: control (C) and exercise (E). The treadmill exercise was preformed at the acute exhaustion exercise. On the day of acute exercise, mice allocated to perform treadmill running were subject to 5% incline and 5min at 10m/min, and then increased 3m/min every 3 minutes. Mice were sacrificed at the indicated time points following treadmill running.Nrf2, phosphor-Nrf2 (Ser40), nuclear Nrf2 protein were measured by Western Blot and Nrf2-ARE binding activity, the mRNA and proetin levels of Nrf2 target genes, key antioxidant enzymes (SOD1, SOD2, CAT, NQO-1) and ROS level, were also measured in skeletal muscles after the interventions. Results: 1) The results showed that compared with WC, RNA and protein expression level of Nrf2 were increased in HC skeletal muscles. Nrf2-ARE binding activity, Nrf2 target gene SOD1, SOD2, NQO-1 mRNA expression and NQO-1 protein expression were also increased in HC skeletal muscles. Meanwhile, ROS level in HC skeletal muscles decreased significantly. 2) After the acute exhaustion exercise, high HIF-1α expression mice (HE) had higher expression of p-Nrf2 (Ser 40) and nuclear Nrf2 protein than the wide type mice (WE). The mRNA expression of SOD1 and mRNA /protein of NQO-1 in HE increased as well. In contrast, ROS level decreased significantly in HE muscles. Conclusion: The result indicated that the proper high expression of HIF-1α could promote the antioxidant capacity of skeletal muscle in mice through Nrf2-ARE pathway.

G804.7

A

1000-677X(2018)11-0060-06

10.16469/j.css.201811006

2018-08-08；

2018-11-06

国家自然科学基金资助项目(31471134)。

王林佳,女,在读博士研究生,主要研究方向为运动生物化学,E-mail:489499191@qq.com。

张缨,女,教授,博士,博士研究生导师,主要研究方向为运动与骨骼肌代谢, E-mail:zhyi9256@126.com。