山葡萄类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的表达分析

陈 蒙，袁赫海，杨铭慧，张 宇，刘海峰

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

山葡萄(Vitisamurensis)为葡萄科葡萄属，主要分布在吉林、辽宁和内蒙古等地区[1-2]，是栽培范围最广泛的果树种类之一，在生产中具有重要地位。

山葡萄果皮颜色的深浅，主要取决于花色苷的含量[3-4]。花色苷功能很多，除了使植物器官产生不同颜色，还作用于种子传播、授粉、抵抗病原物侵染、防紫外线损伤等方面[5-7]。类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(3GT)是花色苷生物合成途径中的关键酶，主要作用是将不稳定的花色苷转变为稳定的花色苷[8]。有学者对多种植物的3GT进行了研究[9-15]，成功克隆出了3GT基因但均未进行蛋白方面的表达研究。本试验根据刘海峰等[16]的方法从山葡萄上分离克隆得到类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(VAm3GT，GenBank登录号：FJ169463)，应用实时荧光定量PCR法对山葡萄果皮8个不同转色时期的VAm3GT表达量进行分析并进行原核表达载体的构建。针对VAm3GT基因进行表达分析，证实克隆所获得的目的基因的准确性，旨在为全面开展花色苷的降解机制、花色苷稳定性研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 试验材料 山葡萄品种双丰(VitisamurensisShuang Feng)采自延边大学农学院山葡萄种质资源圃。于果实成熟期采摘，取果皮作为供试材料，置于液氮中冷冻，-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 试剂 选用试剂盒GoScriptTM(Promega公司)进行RNA反转录；选用SYBR®GreenⅠ试剂盒(QIAGEN公司)进行实时荧光定量PCR检测；大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株DH5α和BL21、原核表达质粒pET28a由延边大学农学院保存； pMD18-T载体、ExTaq-聚合酶(TaKaRa公司)；胶回收试剂盒、限制性内切酶(Promega公司)；T4连接酶、SDS-PAGE电泳凝胶试剂盒(上海生工生物公司)；其他试剂为国产分析纯。

1.2 引物的设计与合成

根据已克隆出的VAm3GT的ORF序列[9]，设计符合实时荧光定量PCR要求的引物为VAm3GT1s：5′-TCGGAAATCTAAACTCGCTCTT-3′，VAm3GT1a：

5′-ATCATTGGTTAGGGAATCGTC-3′，及含有EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点的特异性引物为VAm3GT2s： 5′-cgGAATTCatgtctcaaaccaccaccaaccc-3′(下划线为EcoRⅠ酶切位点)，VAm3GT2a：5′tcCCGGGCtagacatcctttggttttgacact-3′(下划线为SmaⅠ酶切位点)。

1.3 实时荧光定量PCR分析

山葡萄双丰分为8个取样时期：转色前Ⅱ期(花后4周)、转色前、转色10%、转色30%、转色50%、转色80%、转色100%、完熟期。采用改良CTAB法[17]提取山葡萄8个取样时期的总RNA并进行反转录。根据设计的实时荧光定量PCR引物进行扩增，内参基因选用action(Accession No.AB073011)。从8个取样时期的cDNA 模板中任选其一，依次稀释1、5、25、125、625倍制备标准曲线，反应设3个重复，扩增体系：2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix10μL，QN ROX Reference Dye1 μL、引物A 0.5 μL、引物B 0.5 μL、RNase-Free H2O 7μL、模板cDNA1μL、总体积20 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60℃ 退火30 s，60 ℃延伸30 s，40个循环，4 ℃保存。扩增完毕后，对实时荧光定量PCR产物进行熔解曲线分析。利用MxPro软件进行数据处理。

1.4 原核表达载体的构建

以VAm3GT全长cDNA为模版，根据设计的带有酶切位点的引物扩增ORF序列。PCR扩增程序：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃ 变性 30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35个循环，72 ℃终加延伸5 min。

将含有EcoR Ⅰ和SmaⅠ酶切位点的VAm3GTORF和pET28a原核表达载体同时用EcoR Ⅰ和SmaⅠ进行双酶切，回收原核表达载体大片段和目的基因片段并用T4 DNA 连接酶16℃ 连接过夜，体系如下：10×T4 Ligase 2.0 μL、酶切PCR产物1.5 μL、酶切pET28a 3.0 μL、T4连接酶0.5 μL、ddH2O13.0 μL。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于100 mg /L氨苄抗性固体LB培养基37 ℃恒温箱中过夜培养，挑取单克隆进行PCR和双酶切鉴定。

1.5 重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测

将构建成功的重组质粒pET28a-VAm3GT转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，经PCR鉴定后挑取阳性单克隆菌落接种于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中37 ℃过夜培养。取过夜菌100 μL转入5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养至OD600=0.4～0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度分别为0.8、1.0、1.2 mmol/L。置于28 ℃下振荡培养8 h，获得诱导菌液。

重组蛋白的SDS-PAGE检测：取1 mL诱导菌液和诱导前样品，12 000 r/min离心1 min，收集菌体，加入200 μL PBS缓冲液悬浮菌体并用枪头吹打重悬，用反复冻融法裂解细胞；收集混合液后4 ℃、12 000 r/min离心20 min，上清和沉淀样品中分别加入100 μL 5×上样缓冲液并混匀，100 ℃水浴处理8 min。吸取30 μL加样于10% SDS-PAGE电泳，凝胶用考马斯亮蓝染色。

2 结果与分析

2.1 VAm3GT基因的表达分析

2.1.1 山葡萄果皮8个不同转色时期的总RNA 采用改良CTAB法[17]提取山葡萄8个不同转色时期的总RNA，如图1所示。使用核酸检测仪和凝胶成像仪检测RNA浓度和质量，保证RNA完整、无杂质污染，进行反转录。

M：DL 2000Marker，1：转色前Ⅱ期RNA，2：转色前RNA，3：转色10%RNA，4：转色30%RNA，5：转色50%RNA，6：转色80%RNA，7：转色100%RNA，8：完熟期RNA

2.1.2 8个不同转色时期VAm3GT基因的表达分析 选任一时期为对照，以action为内参基因进行实时荧光定量PCR，探究VAm3GT基因在8个不同转色时期的表达规律。如图2所示，VAm3GT基因从转色前Ⅱ期(花后4周)到完熟期表达量逐次递增，呈递增趋势。

图2 VAm3GT基因在8个不同转色时期的表达

2.2 原核表达载体的构建

以VAm3GT全长cDNA为模版，PCR扩增含有EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点的VAm3GTORF序列，扩增产物在1 371 bp出现与预期相符的特异性条带(图3)，回收进行测序鉴定正确后，用于表达载体的构建。将目的片段和表达载体pET28a进行双酶切，用T4 DNA连接酶连接后，获得重组质粒pET28a-VAm3GT原核表达载体，转化并进行PCR鉴定，结果表明，获得的目的条带与预期大小一致，且测序正确，原核表达载体已构建成功。

M：DL 2000Marker，1：目的基因，2：目的基因酶切片段，3：pET28a质粒双酶切，4：重组质粒VAm3GT特异扩增检验

2.3 重组蛋白的诱导表达

将重组质粒pET28a-VAm3GT转化感受态细胞BL21后，加入IPTG诱导菌体表达。在28 ℃培养条件下对IPTG浓度进行筛选，分别为0.8、1.0、1.2 mmol/L，并进行SDS-PAGE电泳检测。目的蛋白在上清中且IPTG诱导浓度为0.8 mmol/L(图4A)，约50.19 ku处有一条与预测重组VAm3GT蛋白相对分子质量大小一致、较高浓度的诱导表达带，沉淀与对照组均未出现目的蛋白条带(图4B)。

M：分子质量标记,1：对照(未经IPTG诱导),2：0.8 mmol/L IPTG,3：1.0 mmol/L IPTG,4： 1.2 mmol/L IPTG

3 结论与讨论

3.1 VAm3GT基因的表达水平分析

8个不同转色时期VAm3GT基因的表达量呈递增趋势，这与彩色马铃薯中3GT基因表达规律相同[18]。黄春辉等[19]证实了花青苷的积累与3GT基因的含量增加具有相关性，因此推测山葡萄果皮逐渐由绿色转变为深红色是由于3GT基因的不断积累。

王惠聪等[7]对荔枝果皮花青苷的研究表明，3GT活性的变化与花青苷含量的变化趋势吻合，随着妃子笑果皮中3GT活性的增加花青苷含量上升。Owens[20]在红葡萄果皮中检测到3GT的表达，而在无花色素苷积累的白葡萄及红葡萄其他组织中没有检测到3GT的表达。3GT酶在山葡萄果皮发育期至全红期表达量缓慢增加，到果实完熟期表达量大幅度增加，催化花青素大量合成。果实在转色前期没有花青素的积累但3GT表达量仍然很高，由此推测山葡萄发育前期3GT酶参并催化合成了黄酮醇类物质[21]。综上所述，VAm3GT基因促进了花色苷的积累，而其含量的增高是否受其他因素如光照、调节酶等影响还有待进一步研究。

3.2 原核表达获得表达蛋白

外源基因能否成功在大肠杆菌中正确表达，受诸多因素影响。不同植物3GT基因的蛋白质分子质量均在50 ku左右。SDS-PAGE电泳检测分析表明，目的蛋白在上清中且IPTG诱导浓度为0.8 mmol/L处有一条与预测重组VAm3GT蛋白相对分子质量大小一致、较高浓度的诱导表达带，沉淀与对照组均未出现目的蛋白条带，这可能与原核表达目的蛋白通常以包涵体的形式表达有关。目的蛋白在IPTG浓度相对低时大量表达，这一结果与牟利等[22]对青稞F7-OMT基因的原核表达分析结果一致。VAm3GT基因在适宜的诱导条件下可得到稳定表达的可溶性目的蛋白。通过对该基因的原核表达，进一步证实了克隆所获得的目的基因的准确性。

本研究成功构建表达载体pET28a-VAm3GT，在28 ℃、8 h，IPTG诱导浓度为0.8 mmol/L条件下，目的蛋白在上清中有较高的表达量，获得了具有较高可溶性且能够高效表达的目的蛋白。为VAm3GT酶活分析、蛋白的纯化以及多克隆抗体的制备等后续试验奠定了基础。