迟缓爱德华菌T3SS转位因子EseC促炎反应

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迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda，简称Et)属于肠杆菌科爱德华菌属，分布广泛，可感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类及人类。Et能够侵染多种鱼类，引起败血症为特征的感染,即迟缓爱德华菌病 (Edwardsiellasis)[1-2]。Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system，T3SS)是细菌中一种接触依赖性的、向宿主细胞中靶向转运毒力因子的装置，是细菌一种重要的毒力因子[3]。Et的主要分泌蛋白(Et secretory protein, EseC)是T3SS一种转位因子。已有研究发现，Et菌eseC基因缺失后，引起Et菌毒力的改变[4]。本研究通过比较eseC基因缺失株和野生株分别感染细胞和组织，探讨Et菌T3SS和感染的细胞、组织，产生炎症反应的关系及机制。

1 材料与方法

1.1菌株和培养基 实验涉及的菌株和质粒见表1，强毒株Et.CD由南京农业大学陆承平教授惠赠。细菌采用LB(Luria Broth)培养基来培养。

表1 菌种及质粒Tab.1 A list of the strains and plasmid used in the study

1.2小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。TRIzol Reagent 试剂，Reverse Transcriptase M-MLV试剂购自Invitrogen公司。BALB/c二级小鼠，6周龄，雌性，购自扬州大学动物模式中心。

1.3eseC基因缺失株及其互补株的构建和鉴定 方法参考文献[5]，以Et.CD的全基因组为模板，用引物eseC-F1-F/R和eseC-F2-F/R(见表2)进行PCR，扩增eseC基因的两侧片段F1和F2，并连接到自杀质粒pHM5，命名重组质粒为pHM-F1F2。用接合方法将该重组质粒从SM10λpir转移到Et.CD，在Ampr和Colr双抗LB平板上，得到含pHM-F1F2的Et.CD菌落。含重组质粒的Et.CD菌落接种LB液体培养基中，过夜培养，在Colr和10%蔗糖的LB平板上，筛选到自杀性质粒脱离的eseC基因缺失株。进一步用PCR鉴定eseC基因缺失株，反复传代后，筛选一株稳定表达的缺失株。

表2 用于构建和鉴定eseC基因缺失株和互补株的引物Tab.2 Primers used to construct and identify the eseC mutant and complementary strain

以Et.CD基因组DNA为模板，PCR扩增eseC基因的片段，引物序列见表2，eseC基因和载体pACYC184连接，得到重组质粒pACYC-eseC。通过电击法将该质粒转入到eseC基因缺失株，在CmrLB平板上，得到含pACYC-eseC的Et.CD菌落，PCR鉴定为eseC基因互补株。

1.4细菌在巨噬细胞内存活实验 将对数期E.coliBL21、Et.CD野生株、eseC基因缺失株和互补株分别感染RAW264.7巨噬细胞，方法参考文献[6]，以培养时间1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h为横坐标，每个细胞内的活菌数(CFU/cell)为纵坐标，取3次实验结果的平均值，绘制细菌胞内细菌数目和时间曲线。

1.5CCK-8法检测细菌株感染巨噬细胞后的细胞存活率 分别以不同的MOI(1∶1、1∶10、1∶100)对数期Et.CD野生株、eseC基因缺失株和互补株，感染96孔板中RAW264.7细胞2 h，PBS漂洗细胞3遍，每孔加入10 μL CCK-8溶液，以不加细胞的孔作为空白对照，在细胞培养箱中孵育1 h。用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值，取3个平行对照孔的平均值。细胞存活率=(处理细胞孔的吸光度-空白对照孔吸光度)/(未处理细胞孔的吸光度-空白对照孔吸光度)×100%。

1.6Annexin V-FITC检测细胞坏死 以10∶1 MOI Et.CD野生株、eseC基因缺失株和互补株分别感染RAW264.7巨噬细胞2 h或6 h，方法参考文献[7]，用流式细胞仪检测：细胞坏死率=坏死细胞/所有细胞×100% (Ex:488 nm; Em:530 nm)。

1.7细菌在小鼠体内存活实验 方法参考文献[7]，实验动物分为3组：Et.CD野生株组、eseC基因缺失株组和PBS对照组。腹腔注射每只小鼠的细菌剂量200 μL, 5×106cfu/mL；在感染后不同时间点12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、15 d和21 d，每个时间点断脊处死每组3只小鼠，无菌操作迅速取出肝脏、肺脏、脾脏和肾脏，各加入1 mL含有0.1% TritonX-100的PBS，用玻璃匀浆器制成匀浆，取组织匀浆进行10倍系列稀释，选取适当稀释度的匀浆液100 μL涂LB平板，计算每个时间点每组不同组织内细菌CFU/mL的平均值。

1.8细菌感染后小鼠组织病理的改变 细菌感染小鼠的方法同1.7，断脊处死小鼠，迅速解剖，取出小鼠的肝脏、肺脏、脾脏和肾脏进行观察；先用PBS洗去血液，再浸于10%中性福尔马林溶液中固定48 h；经冲洗、脱水、常规石蜡包埋，制成切片后进行苏木素-伊红(HE)染色，Olympus BX50生物显微镜观察。

1.9ELISA检测小鼠血清细胞因子IL-1β和 TNF-α 细菌感染小鼠的方法同1.7，毛细玻璃管采小鼠眼球血，方法同试剂说明书，加入稀释250倍的抗相关细胞因子的抗体的包被液，4 ℃过夜；洗涤后，再加入相关细胞因子稀释的标准品，设空白对照为标准曲线零点。待测血清稀释10倍，37 ℃ 3 h；洗涤后，加入酶标检测抗体，37 ℃ 1 h；加入稀释250倍的亲和素-辣根过氧化物酶，37 ℃ 30 min；加底物显色；终止显色反应；使用酶标仪测定450 nm处的吸光值，设定570 nm作为校正波长。

1.10RT-PCR 按试剂盒说明书，方法参考文献[7]，分别提取对数期Et.CD野生株和eseC基因缺失株RNA，将RNA逆转录成cDNA。再以cDNA为模版，用T3SS效应蛋白eseE基因的引物(F-CTTCCTGGAGAGCGAGTT, R-CAGCATCACAT-CCGTCAG)和T3SS效应蛋白eseJ基因的引物(F-GGAT TATGATGATA CGACACAG, R-GCTGATACACCTGCTGATT)分别扩增两基因，以扩增16SrRNA基因(F-GATTCGCTGGATGTCAAGA, R-GCTGGTCTGAGAGGATGA)作为内标参照，定量检测各基因的转录水平。

1.11统计学分析 比较细菌存活率之间、细胞存活率之间和细胞因子浓度之间的差异，采用t检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1比较野生株和eseC基因缺失株在巨噬细胞内存活的差异 如图1显示，E.coliBL21不能在巨噬细胞内生长繁殖的，随着培养时间的延长，胞内细菌的数目逐渐减少；野生株和eseC基因缺失株在巨噬细胞内的细菌数目在一段时间内呈上升趋势，野生株在延长培养12 h后达到最高；而eseC基因缺失株在延长培养24 h后达到最高。在延长培养到6 h和12 h时，缺失株胞内细菌数目明显低于野生株(t=7.046,t=4.406;P<0.05)，互补株的变化趋势接近野生株。这表明eseC基因对于维持Et在巨噬细胞内的繁殖速率起重要的作用。

*：表示P<0.05图1 比较野生株和eseC基因缺失株在巨噬细胞内细菌数目的差异Fig.1 Comparison of the differences between the bacterial numbers of the wild type and ΔeseC strains within macrophages

2.2比较野生株和eseC基因缺失株株感染巨噬细胞后的细胞存活率 结果如图2表明，当MOI为10∶1和100∶1时，野生株感染巨噬细胞后的细胞存活率明显低于缺失株组(t=27.67,t=27.33;P<0.05)，互补株组与野生株组的细胞存活率没有明显差别(t=2.48,P>0.05)，说明eseC基因缺失后，Et感染巨噬细胞后，细胞存活率明显降低。

*：表示P<0.05图2 比较野生株和eseC基因缺失株对巨噬细胞毒性的差异Fig.2 Comparison of the differences between the toxicity to the macrophages infected by the wild type and the one by ΔeseC strains

2.3比较野生株和eseC基因缺失株诱发巨噬细胞坏死的差异 细菌感染细胞2 h流式结果如图3所示：未感染细菌的细胞双染对照组，早期坏死的比率为0.87%(图3A)；Et野生株组早期细胞坏死率为11.11%(图3B)，缺失株组早期细胞坏死率为3.85%，互补株组早期细胞坏死率为4.44%(图3D)。细菌感染细胞6 h流式结果如图3所示: 未感染细菌的细胞双染对照组，晚期坏死的比率为1.24%(图3E)；Et野生株组晚期细胞坏死的比率为38.05%(图3F)；缺失株组晚期细胞坏死率为20.36%(图3G)；互补株组晚期细胞坏死率为37.10%(图3H)。因此，Et可通过其三型分泌系统早期或晚期均诱导巨噬细胞发生坏死。

2.4比较野生株和eseC基因缺失株感染小鼠，在肝、肺、脾和肾中细菌存活数目的差异 如图4显示，和野生株比较，缺失株虽然也入侵肝脏、脾脏、肾脏和肺脏，但在这些器官内检出的细菌数量低于野生株，表明eseC基因缺失株在宿主体内的细菌存活数目明显降低。

2.5比较野生株和缺失株感染小鼠(腹腔注射)后，引起小鼠组织的病理改变的差异 如图5所示：野生株和eseC缺失株分别感染小鼠3～5 d时,发现野生株组肝脏、脾脏和肺脏与对照组的外观差异显著，缺失株组与对照组的外观差异无显著；野生株组的肾脏、缺失株组和对照组的外观在小鼠感染各个时期均未有明显的差别。

PBS对照组小鼠肝脏(图6A)、脾脏(图6D)、肺脏(图6G)和肾脏(图6J)的结构清楚，组织细胞无水肿、无坏死。细菌感染小鼠后，组织病理变化最明显的时间是：肝脏(3 d)、脾脏(3 d)、肺脏(5 d)和肾脏(7 d)(见图6)。野生株感染组织的主要病理改变：大量的炎性细胞浸润，肝细胞水肿和变性(图6B)、脾窦扩张和充血(图6E)、肺泡上皮细胞变性和坏死(图6K)、肾小管上皮细胞变性和坏死(图6K)，这些提示野生株对小鼠的肝脏，脾脏、肺脏和肾脏有明显的急性炎症反应和毒性作用，而eseC基因缺失株对肝脏(图6C)，脾脏(图6F)、肺脏(图6I)肾脏(图6L)的急性炎症反应和毒性作用均明显减轻。这说明eseC基因缺失以后，Et菌对宿主的病理损伤明显减轻。

图3 比较野生株和eseC基因缺失株感染巨噬细胞诱发细胞坏死率的差异Fig.3 Comparison of the differences between the cell necrosis rates of macrophages infected by the wild type and the ones did by the ΔeseC strain

图4 比较野生株和eseC基因缺失株在小鼠组织中存活数的差异Fig.4 Comparison of differences between the survival numbers of the wild type and the ones of the ΔeseC strains in the tissues of mice

图5 比较野生株和eseC缺失株感染小鼠后组织外观的差异Fig.5 Comparison of difference between the tissue sizes of mice infected by the wild type and ones did by the ΔeseC strains

图6 比较野生株和eseC基因缺失株感染小鼠后各组织病理改变的差异(×400)Fig.6 Comparison of difference between pathological damage of the tissues of mice infected by the wild type and the ones did by the ΔeseC strain(×400)

2.6比较野生株和eseC基因缺失株感染小鼠血清IL-1β和TNF-α浓度的差异 感染1-11 d后，野生株组中小鼠血清中的IL-1β和TNF-α的浓度均明显高于缺失株组(t=2.979,t=3.103;P<0.05)。感染后1 d时，野生株组中小鼠血清中IL-1β的浓度达到了最高，且明显高于缺失株组(t=6.748，P<0.05)(图7A)；感染后3 d时，野生株组小鼠血清中TNF-α的浓度达到了最高，且明显高于缺失株(t=5.237，P<0.05)(图7B)。结果表明，eseC的缺失影响了Et诱发炎性细胞因子的产生。

2.7RT-PCR检测eseC基因对T3SS效应蛋白的作用 结果如图8所示：eseC基因缺失株T3SS效应蛋白基因eseE和eseJ的转录水平和野生株相比明显降低，而互补株的eseE和eseJ的转录水平与野生株之间并未有明显差别。这表明eseC基因的缺失影响了效应蛋白EseE和EseJ分泌到宿主细胞内发挥效应。

图8 比较野生株和eseC基因缺失株的T3SS效应蛋白基因eseE和eseJ转录水平的差异Fig.8 Comparison of the differences between the transcriptional levels of eseE and eseJ of the wild type and the ones of the ΔeseC strains

3 讨 论

Et菌T3SS的基因簇由35个开放阅读框构成，以毒力岛的形式存在于细菌的染色体上，Et 菌的毒力岛与鼠伤寒沙门氏毒力岛(SalmonellatyphimuriumPathogenicity island SPI-2)有较高的同源性[3]。沙门氏SPI-2拷贝的T3SS有助于该菌的系统感染[8]， 因此，我们选择将Et菌腹腔注射途径，研究Et菌T3SS的功能。

根据T3SS功能可大致分为4类[3]：①装置蛋白，其中 EseB、EseC和EseD组成T3SS的尖端结构，被称为转位子蛋白(translocon)；②效应蛋白，这是III型分泌系统发挥毒力的部分，可以直接通过分泌系统进入宿主细胞，实现对宿主细胞的影响；③伴侣蛋白；④调节蛋白。Xie等研究表明，效应蛋白EseG可影响哺乳动物细胞中的微管结构重排，与细菌的致病机制有关[9]；效应蛋白eseJ基因缺失株不能在上皮细胞和巨噬细胞内增殖，并且其毒力比野生株显著降低[10]。

Et菌是一种兼性胞内寄生菌，能够在吞噬细胞存活和繁殖，最终释放出来，扩散到宿主全身。因此，我们比较了Et.CD野生株和eseC基因缺失株在巨噬细胞内存活率和细胞存活率的结果，说明野生株感染细胞后，引起更多细胞的死亡，释放出更多细菌成份，如LPS 和T3SS，这些细菌成份为病原体相关模式分子(Pathogen associated molecular pattern, PAMP)可以诱导吞噬细胞参与炎症反应[11]。我们比较野生株和eseC基因缺失株诱发巨噬细胞坏死的结果表明，野生株可通过其T3SS诱导更多巨噬细胞发生坏死。细胞炎性坏死，伴有大量促炎症因子的释放[11]。此外，我们比较野生株和eseC基因缺失株感染小鼠，在肝、肺、脾和肾中细菌存活数目的结果表明，T3SS有助于野生株在组织中的大量增殖。

我们采用动物体内的研究表明，野生株感染小鼠后，它们的肝脏，脾脏、肺脏和肾脏有明显的急性炎症反应，外观明显肿大，eseC基因缺失株感染小鼠后，这些组织的急性炎症反应明显减轻。野生株诱发小鼠血清炎性细胞因子TNF-α和IL-1β浓度的产生明显高于缺失株。我们进一步用RT-PCR检测eseC基因对T3SS效应蛋白EseE和EseJ的作用，结果表明， EseC 缺失影响了效应蛋白EseE和EseJ分泌到宿主细胞内发挥效应，影响了Et的致炎作用。