华支睾吸虫排泄分泌抗原McAb的制备及双抗夹心ELISA的初步建立

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华支睾吸虫病是由华支睾吸虫(ClonorchisSinensis)(又称肝吸虫)感染引起重要食源性寄生虫病[1]。成虫寄生在肝胆管内，其分泌物、代谢产物和机械刺激等因素可诱发胆管内膜及周围的慢性炎性反应，继而出现管壁增厚、胆管局限性扩张及门脉周围纤维组织增生[2]。目前临床常用的实验诊断是病原学检查，主要为涂片法、集卵法、十二指肠引流胆汁等，但总体检出率较低。免疫学诊断方法具有检测快速、操作简便的特点，而利用单克隆抗体(McAb)技术研发免疫学诊断试纸盒能够为华支睾吸虫病的现症诊断、虫荷估计、疗效考核和预后判断提供新的手段。应用单克隆抗体检测寄生虫抗原比如血吸虫虫卵抗原、循环多糖抗原及特定分子等研究中，都取得较为满意的结果[3]。本研究通过制备抗华支睾吸虫排泄/分泌抗原(ESA)的单克隆抗体，并进一步建立双抗体夹心的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法，以期为临床提供更为方便有效的诊断手段。

1 材料与方法

1.1主要试剂和耗材 HAT/HT培养基、福氏佐剂、SBA Clone typing TM system/HRP抗体亚类试剂盒购自美国Sigma公司；50%聚乙二醇1500购自德国Merck公司；胎牛血清，DMEM培养基等购自美国invitrogen公司；96孔酶标板和细胞培养板购自美国Costar公司。其他常规化学试剂均为国产分析纯。

1.2动物和细胞 健康雌性SPF级Balb/c小鼠，6～8周龄10只，体重14～17 g，购自南京医科大学实验动物中心[SCXK(苏)2002—0031]；Sp2/0骨髓瘤细胞本室保存。

1.3 方法

1.3.1肝吸虫排泄/分泌抗原(ESA)制备 分离华支睾吸虫感染家兔肝脏内活动良好的成虫，在DMEM 培养液中37 ℃、5% CO2条件下无菌培养，12 h后收集培养液，离心取上清，检测浓度后-80 ℃保存备用。

1.3.2动物免疫 选择生长良好的6～8周龄、雌性Balb/c小鼠5只，以上述制备的ESA进行免疫，另设对照组小鼠3只。将ESA溶于360 μL生理盐水中，充分混匀，加入等体积的福氏佐剂，100 μg/只小鼠抗原量背部皮下多点注射，0.2 mL/点，2～5点/只，第3轮免疫不再用佐剂，融合前3 d同样抗原量内眦静脉注射，以加强免疫。对照组小鼠注射生理盐水。

1.3.3细胞融合 经过3轮的基础免疫和一次加强免疫，取小鼠脾脏，常规制备单个细胞悬液，细胞计数，取1×108脾细胞与2×107骨髓瘤细胞系SP2/0(5∶1)用50% PEG融合剂，按常规方法融合并对融合后细胞进行克隆化培养[4]。选择生长良好、抗体分泌量高的杂交瘤细胞株继续扩大培养并及时液氮冻存。

1.3.4单克隆抗体的制备及纯化 小鼠腹腔内注射液体石蜡进行预处理(0.5 mL/只)，将分泌特异McAb的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，收集腹水，离心去杂质后用33%饱和硫酸铵沉淀2次并4 ℃透析24 h纯化抗体，利用DEAE-SephadexA52层析柱，收集洗脱液中蛋白并浓缩， SDS-PAGE 检测纯化IgG的纯度。

1.3.5杂交瘤细胞上清液抗体效价的测定 采用间接ELISA法对杂交瘤细胞上清液进行抗体效价测定，倍比稀释成不同的浓度，同时设立阴性对照及空白对照，以P/N>2的抗体最大稀释度作为效价终值。

1.3.6单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定 采用SBA Clone typing TM system/HRP抗体亚类试剂盒，按说明书方法进行测定。取已包被好的酶标板，加入杂交瘤细胞上清，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，封闭后加入工作浓度的羊抗鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，HRP标记羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤5次，100 mL/孔加入显色液，37 ℃闭光显色15 min，加终止液。

1.3.7 双抗体夹心ELISA法的建立

1.3.7.1辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗 常规过碘酸钠法标记抗体。

1.3.7.2抗体工作浓度的确定 分别对包被抗体和酶标抗体梯度稀释，棋盘滴定法确定其最佳反应条件；磷酸盐缓冲液(PBS)稀释单抗后，100 μL/孔包被酶标板并4 ℃过夜；0.05% Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，3 min/次；5%脱脂奶粉37 ℃孵育1 h；加入待检样品，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板3次，3 min/次；加入辣根过氧化物酶标记的单抗，37 ℃孵育2 h，洗板；常规TMB底物显色，2 mol/L的浓硫酸50 μL/孔终止反应，检测酶标仪450 nm处光密度值(optical density, OD450)。以抗体稀倍数较高且阳性对照/阴性对照OD值最大时，包被抗体和酶标抗体的组合作为抗体的工作浓度，初步建立双抗体夹心ELISA体系。

1.3.7.3绘制标准曲线 应用初步建立的双抗体夹心ELISA方法，检测梯度稀释的ESA并进行做线性回归分析，以大于阴性对照2倍为Cutoff值，确定检测最佳线性范围。

1.3.7.4单克隆抗体特异性试验 用建立的ELISA方法检测其与日本血吸虫成虫抗原、猪囊尾蚴抗原、疟原虫抗原交叉反应性，确定该ELISA方法的特异性。

2 结 果

2.1感染小鼠血清抗体效价经过三轮基础动物免疫后，内眦取血法采集免疫小鼠血清，ELISA法检测血产生抗体的效价，检测结果(见表1)显示，用于融合的小鼠血清抗体效价至少达1∶400以上，表明此小鼠的脾脏可作为融合所用脾细胞的来源。

表1 免疫小鼠血清抗体效价测定结果(OD450)Tab.1 Result of determining valence of antibody in the immuned mouse

2.2杂交瘤细胞的筛选 细胞融合后，挑选生长状态良好的细胞孔进行ELISA抗体检测，对结果阳性值高的细胞孔铺板克隆化培养(图1、图2)。经过3轮筛选后，最后得到2株杂交瘤细胞株，命名为B7、F1。

2.3杂交瘤细胞上清液抗体效价测定 对杂交瘤细胞株B7上清液进行抗体效价检测，挑选出单细胞生长孔对其进行ELISA检测(表2)，结果显示82个细胞孔抗体阳性率为100%，且OD450值结果趋于一致，说明其具有较好的稳定性。

图1 杂交瘤细胞克隆化培养第3 d细胞形态 (A：×100；B：×400)Fig.1 Morphology of hybridoma cell-3d after cloning of cultivation

图2 杂交瘤细胞亚克隆化培养第8 d细胞形态(A：×100；B：×400)Fig.2 Morphology of hybridoma cell-8d after cloning of cultivation (A: ×100; B: ×400)

表2 杂交瘤细胞株B7第四轮筛选后ELISA 检测结果Tab.2 values of B7 after the fouths creening by ELISA

2.4单克隆抗体亚类鉴定 吸取杂交瘤细胞培养上清液，按照SBA Clone typing TM system/HRP抗体亚类试剂盒检测方法鉴定细胞株分泌的单克隆抗体的抗体亚类均属IgG1。

图3 抗体亚型检测(OD450)Fig.3 Identification of antibody subtypes (OD450)

2.5单克隆抗体纯化效果分析 对纯化后单抗进行SDS-PAGE分析显示，纯化后的两株单抗均在分子量26 kD大小处出现一条轻链，在50 kD左右出现一条重链，且无其他明显杂带。结果表明抗体纯化效果较好，纯度较高。

M: 蛋白分子质量标准；B7/F1: 纯化的B7/F1 McAbs图4 纯化单克隆抗体的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of purified McAb

2.6抗体工作浓度的确定 对包被抗体及酶标标记抗体进行梯度稀释，利用棋盘滴定法确定其工作浓度，实验表明以抗体B7 包被，以F1 标记HRP做酶标抗体效果较好，根据实验结果(表3)，确定包被抗体浓度为10 μg/mL，酶标抗体的稀释倍数为1∶2 000，此条件下阳性/阴性值最大。

2.7标准曲线的绘制及体系灵敏度的确定 将ESA进行连续倍比稀释，应用初步建立的双抗体夹心ELISA方法，以稀释的ESA浓度值的对数值为自变量，以测得OD450值的对数值为因变量，绘制标准曲线。结果如图5，分析得标准曲线方程为y=1.078 9x-2.174 8，R2=0.996 9，检测最佳线性范围为0.014～0.248 μg/mL，最低检出值0.014 μg/mL。

表3 包被抗体和酶标抗体工作浓度的确定Tab.3 Conformation of the optimal antibody concentration

图5 双抗体夹心法检测ESA的标准曲线Fig.5 Standard curve of double antibody sandwich method to detect ESA

2.8ELISA法特异性测定 以建立的双抗夹心ELISA法检测与其他寄生虫抗原的反应性，结果显示， 3种寄生虫检测OD450值均小于0.1，表明建立的ELISA法与其他抗原无交叉反应，特异性较强。

表4 抗体特异性检测Tab.4 Specificity of antibodies

3 讨 论

华支睾吸虫成虫寄生于人或其它终宿主的肝胆管内，可引起胆管的炎症反应，甚至诱发肝胆管癌，防治工作刻不容缓，而提高华支睾吸虫病的诊断水平是开展流行病学调查以及开展临床检测的重要环节。随着近代免疫学的高速发展，免疫诊断方法在临床辅助诊断以及流行病学调查中占据越来越重要的地位，研制开发快速、方便、敏感性高、特异性强的肝吸虫病诊断工具是及时治疗患者的重要保障。目前，华支睾吸虫病的免疫诊断还面临着诸如假阳性、假阴性和交叉反应等许多问题影响诊断结果，故检测方法必须具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点，而单克隆抗体基本可以满足这些要求。虽然近年来出现了一些如转基因小鼠技术[5]、嵌合单抗技术[6]、核糖体展示技术[7]、噬菌体展示技术[8]等新型抗体制备手段，但是这些技术目前尚未发展成熟，且传统杂交瘤细胞的制备技术成熟稳定、操作简便、成本较低等优点，因而本研究仍采用传统杂交瘤技术，利用三轮基础免疫和一次加强免疫，提高免疫效果及抗体效价，安全可靠。

寄生虫的排泄分泌抗原(ESA)主要由虫体排泄或分泌的物质释放到虫体外寄生部位，与其宿主细胞直接接触，能够引起一系列的生物效应，具有重大的临床诊断意义[9]。华支睾吸虫ESA在幼虫移行至肝胆管最终导致胆管及肝脏致病过程中发挥重要作用[10]。我们利用制备的ESA免疫小鼠，经过细胞融合、克隆化培养、抗体制备及纯化后，得到两株高效、特异的单克隆抗体B7/F1，在此基础上，我们进一步利用这两株单抗建立了双抗体夹心ELISA法，实验验证其其灵敏度达到0.014 μg/mL，且特异性较高，为ESA的有效检测提供了参考。双抗夹心ELISA的免疫学检测方法因其灵敏度高、特异性强等优势，已被广泛应用如病毒[11]、细菌[12]、人体激素[13]、食品安全[14]等检测领域。我们将利用建立的双抗体夹心ELISA法进行初步的临床应用，有望将其开发成为华支睾吸虫检测试剂盒，为华支睾吸虫病的临床检测提供新的手段。