宫颈脱落细胞miR34a检测在HR-HPV阳性患者分流中的作用分析

聂小凤 翟慧慧 冷天艳 张琴 杨丽华

摘   要：目的  探讨宫颈脱落细胞miR34a检测在HR-HPV阳性患者分流中的作用。方法  采用第二代杂交捕获技术（HC2）进行宫颈癌初筛，HPV阳性者行TCT及miRNA检查。TCT结果异常者（≥意义不明确的非典型鳞状细胞）阴道镜下活检行病理学检查。TCT阴性者行阴道镜检查，阴道镜异常者阴道镜下活检取材，比较不同级别宫颈病变中miR34a水平，探讨miR34a、Pap在宫颈病变中的诊断作用。结果  ①Pap对宫颈高度鳞状上皮内病变预测值的灵敏度为64.90%，特异度为80.70%，AUC为0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）。②miRNA34a对宫颈高度鳞状上皮内病变预测值的灵敏度为77.00%，特异度为62.30%，AUC为0.824（95%CI：0.756～0.892，P<0.001），cut off值为0.623。③miRNA34a对宫颈高度鳞状上皮内病变预测值的灵敏度高于Pap检测，特异度低于Pap。④宫颈脱落细胞miRAN34a值随着宫颈病变加重逐渐降低。结论  检测宫颈脱落细胞miR34a水平可有效分流HR-HPV阳性患者，敏感性高于Pap检查。

关键词：microRNA-34a;宫颈细胞学检查;HPV;宫颈癌;筛查

中图分类号：R737.33                                   文獻标识码：A                             DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.16.012

文章编号：1006-1959（2018）16-0043-04

Analysis of the Role of MiR34a in Cervical Exfoliated Cells in Shunt of HR-HPV Positive Patients

NIE Xiao-feng，ZHAI Hui-hui，LENG Tian-yan，ZHANG Qin，YANG Li-hua

（Department of Gynecology，Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，650101，Yunnan，China）

Abstract： Objective  To investigate the role of miR34a in cervical exfoliated cells in the shunt of HR-HPV positive patients. Methods  The second generation hybridization capture technique （HC2） was used for primary screening of cervical cancer. HPV positive patients underwent TCT and miRNA examination. Pathological examination of colposcopy biopsy was performed in patients with abnormal TCT results （≥ atypical squamous cells with unclear significance）. TCT-negative patients underwent colposcopy， colposcopy biopsy was performed， and miR34a levels were compared in different grades of cervical lesions. The diagnostic role of miR34a and Pap in cervical lesions was explored. Results  ① The sensitivity of 1Pap to the predictive value of high squamous intraepithelial lesion was 64.90%， the specificity was 80.70%， and the AUC was 0.728 （95% CI： 0.657～0.779， P<0.001）.② The sensitivity of miRNA34a for predicting cervical high-grade squamous intraepithelial lesion was 77.00%， specificity was 62.30%， AUC was 0.824 （95% CI： 0.756～0.892， P<0.001）， and cut off value was 0.623. ③The sensitivity of 3miRNA34a to the predictive value of high squamous intraepithelial lesion was higher than that of Pap， and its specificity was lower than Pap. ④ The value of miRAN34a in cervical exfoliated cells gradually decreased with the increase of cervical lesions. Conclusion  Detection of miR34a levels in cervical exfoliated cells can effectively divert HR-HPV-positive patients with higher sensitivity than Pap.

Key words：MicroRNA-34a;Cervical cytology;HPV;Cervical cancer;Screening

宫颈癌（cervical cancer）是发展中国家女性常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升[1]。高危型人类乳头状瘤病毒（highrisk human papillomavirus，HR-HPV）持续感染是宫颈癌的病因，因此，HR-HPV DNA检测成为宫颈癌筛查的方法主要之一[2]。宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）为宫颈癌癌前病变。通过筛查发现CIN，及时治疗，是预防宫颈癌的有效措施。大量证据表明，HR-HPV测定较细胞学检测在识别高级别CIN 具有更高的敏感性，但是特异性低[3-5]。2015年1月美国阴道镜及宫颈病理学会（American society for colposcopy and cervical pathology，ASCCP）和妇科肿瘤协会（society of gynecologic oncology，SGO）更新了宫颈癌筛查指南，推荐HPV初筛可用于现代宫颈癌筛查的替代方案[6]。HPV感染是频发事件，大多数HPV感染是一过性的，90%的HPV感染在2年内可自然消除[7，8]。因此，对HPV阳性的女性必须进行相关检测以识别CIN，称之为分流。细胞学检查是首选的分流方法，但细胞学结果敏感性低，准确性依赖于读片人员，因此寻找细胞学以外的分流方法是当前研究重点。MicroRNAs（miRNAs）是重要的基因调节因子，在多种肿瘤中异常表达。近年来有研究报道，miRNA可作为肿瘤诊断的生物标记物[9]。在宫颈癌发生中，miR-34a因为与E6蛋白作用的靶基因P53密切相关而受到关注。miR-34a是P53下游靶基因，HPV-E6蛋白靶向P53基因，P53失活导致miR-34a数量降低，调节细胞凋亡、G1期阻滞、DNA修复和凋亡的蛋白失活，因此，细胞增殖促进肿瘤的发生[10]。miR-34a水平的降低可代表HPV病毒与宿主细胞的整合，是宫颈发生病变的标识，miR-34a水平的检测可能可作为宫颈癌筛查中HPV阳性的妇女的有效分流方法， 因此，本课题拟通过检测HPV感染阳性患者宫颈脱落细胞miR-34a水平，与液基细胞学结果相比，比较miR-34a测定在HPV阳性患者分流中的作用，为宫颈癌筛查中HPV阳性的患者提供更敏感、客观的分流指标提供依据。

1资料与方法

1.1一般资料  收集2015年10月～2017年4月昆明醫科大学第二附属医院妇科进行宫颈癌筛查的患者30000例，年龄25～70岁，平均年龄（37.33±5.28）岁，均有性生活史，均经知情同意，进行HPV DNA检测，HPV阳性者行TCT及miRNA检查。TCT 结果≥意义不明确的非典型鳞状细胞（ASCUS）者为TCT阳性，TCT阳性者直接阴道镜下活检行病理学检查;TCT阴性者行阴道镜检查，阴道镜异常者阴道镜下活检取材。

1.2 HPV检测  由经过培训的妇科医生取样，用HPV采样器于宫颈管内，同一方向旋转3圈，置于样品保存液中，4 ℃保存待检测。采用HPV-DNA杂交捕获Ⅱ代试验，利用免疫学技术并通过化学发光使基因信号放大的微孔板对标本中的病毒进行微量检测。检测14种高危型HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。其结果以标本的相对荧光光度值（RLU）与阳性定标的域值（CO）的比值表示，RLU/CO≥1.0为阳性，相当于标本中检出DNA负荷量≥1.0 pg/ml，反之RLU/CO<1.0 pg/ml为阴性。

1.3 TCT、miR-34a检测  由经过培训的妇科医生取样，应用液基细胞学取样器，于宫颈管内旋转3～5圈，每个患者取样2个，1个置于液基细胞的保存液中，送病理科检查。宫颈细胞学检测按照TBS分级系统评价标准分类：①正常范围（WNL）;②不典型鳞状细胞（ASCUS）;③不能排除高级别鳞状上皮内病变不典型鳞状上皮细胞（ASC-H）;④低级别鳞状上皮内病变（LSIL）;⑤高级别鳞状上皮内病变（HSIL）;⑥鳞状细胞癌（SCC）。1个应用RT-PCR检测宫颈脱落细胞miR-34a表达水平，收集在Trizol商品化试剂盒，Trizol法提取细胞中总RNA，按照miR检测试剂盒说明，应用RT-PCR法测量miR-34a表达。

1.4组织学诊断  TCT检查异常者90例，TCT正常，阴道镜检查异常者202例，共292例患者在阴道镜下进行活检。根据2014年第四版WHO女性生殖器官肿瘤分类将疾病分为两个级别：低度鳞状上皮内病变（LSIL）和高度鳞状上皮内病变（HSIL）[11]。

1.5统计学处理  采用SPSS22.0软件包进行统计学分析。ROC曲线用于分析Pap、miR-34a检测在高级别宫颈上皮内瘤变诊断中的价值，根据最大约登指数确定Pap、miR-34a的cut off值，比较TCT、miR-34a诊断HSIL的敏感性、特异性，评价宫颈脱落细胞miR-34a检测在HR-HPV阳性患者的分流作用。所有统计学分析均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.001表示统计学意义极显著。

2结果

2.1研究对象基本信息  30000例女性参加HPV检测的初筛，其中1140例HPV阳性。450例女性因不愿继续检测，690例继续筛查，行Pap、miRNA检测，95例女性因为取出标本细胞过少无法行miRNA检测，仅行Pap检测，595例女性完成了Pap检测和miRNA检测。其中90例女性Pap结果异常，直接阴道镜下活检。505例Pap结果未见异常行阴道镜检查，阴道镜检查结果正常303例，阴道镜结果异常202例，阴道镜异常者行宫颈活检，共292例行阴道镜下活检。292例宫颈活检组织学结果：正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例。

2.2不同级别宫颈病变宫颈脱落细胞miRNA34a水平  RT-PCR检测宫颈脱落细胞miR-34a表达水平，发现随着宫颈病变程度的增加，miRNA34a的表达水平逐渐下降，miR-34a表达值在正常组、LSIL组、HSIL组及CC组分别为（0.74±0.07）×10-3、（0.61±0.06）×10-3、（0.52±0.08）×10-3、（0.35±0.09）×10-3，且与正常组及LSIL组相比，HSIL组及CC组均较低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 Pap结果与宫颈病变的关系  292例（Pap阴性202例，Pap阳性90例）进行宫颈活检，组织学结果显示：正常组189例，其中Pap阴性161例，Pap阳性28例;LSIL组29例，其中Pap阴性15例，Pap阳性14例;HSIL组71例，其中Pap阴性26例，Pap阳性45例;CC组3例，其中Pap阴性0例，Pap阳性3例。

2.4 Pap对HSIL的预测作用  Pap对诊断HSIL的预测值的灵敏度为64.90%，特异度为80.70%，AUC为0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001），见图1。

图1   Pap诊断HSIL的ROC曲线

2.5 miRNA34a对HSIL的预测作用  miRNA34a对诊断HSIL的预测的灵敏度为77.00%，特异度为62.30%，AUC为0.824（95%CI：0.756～0.892，P<0.001），cut off值为0.623，见图2。

图2   miRNA34a诊断HSIL的ROC曲线

3讨论

2015年1月美国阴道镜及宫颈病理学会（ASCCP）和妇科肿瘤协会（SGO）更新了宫颈癌筛查指南，推荐HPV初筛可用于现代宫颈癌筛查的替代方案，HPV检测敏感性高，能够最大限度地筛查出疾病。但是HPV感染率较高，绝大多数感染是一过性的，90%的感染在2年内清除，也就是说大多数妇女感染HPV后可以自行清除病毒，仅有部分患者持续感染，持续感染的妇女中也仅有部分患者发生CIN或宫颈癌[7，8]。因此，HR-HPV初筛阳性妇女必须分流，HPV检测的目的不是明确是否有HR-HPV感染，而是预测是否存在高级别CIN，避免处理一过性HPV感染及其相关的良性病变。目前，细胞学检查是首选的分流方法[12]，细胞学筛查的特异性较高，可达到90%以上，但其敏感性只有42%～73%[13，14]。我国宫颈癌的筛查起步较欧美等西方发达国家晚，由于经济发展和技术力量的不均衡，很难有一个全国统一的筛查策略，国内的医生大多数采用或借鉴国外的筛查经验。现阶段国内尚缺乏针对宫颈癌筛查策略的大样本多中心的随机研究，对于HPV感染的型别分布各个研究中心也不统一。另外，我国缺乏经历正规培训的有经验的细胞学病理专家，细胞学分流的作用受到更大的挑战。加上我国目前特殊的医疗环境、敏感的医患关系，为避免HPV阳性的妇女漏诊可能存在的CIN，临床医生可能会更多的推荐阴道镜检查甚至是宫颈活检以明确诊断。对HPV阳性的妇女采用抗病毒、免疫治疗等“更积极”“更迎合”患者恐癌、惧癌，要求治疗的心态，以避免因为目前分流措施不完善可能导致的漏诊。因此，我们更需要探讨简便、敏感性强、特异性高的HPV阳性患者的分流方法。

微RNA（microR-NA，miRNA）是一类内源性的非编码单链小分子RNA，长度约为18～25个核苷酸，可与靶信使RNA（mRNA）3'端非翻译区（3'-UTR）互补配对结合，进而引起靶mRNA降解或翻译抑制，调控基因表达。根据生物信息学推测，大约30%以上的人类基因受到miRNA的调控[15]。现有研究表明，HPV表达的致癌蛋白E6、E7和E5直接或间接导致了多种mi-RNAs，如miR-34a、miR-218、miR-29a及miR-146a 等表达改变，进而导致宫颈癌的发生发展，而少数mi-RNAs如miR-203及miR-125b等还参与了HPV病毒DNA的复制[16，17]。

miR-34a家族因为其与HPV蛋白之间可能的反应，在HPV感染、宫颈癌发生、发展中的作用被研究。miR-34家族包括3种同源基因，分别是miRNA-34a、miRNA-34b、miRNA-3c。其中miRNA-34a位于1p36.23，含有两个外显子，两个外显子之间间隔约30kb的内含子，编码成熟miRNA-34a的序列位于第二外显子。miRNA-34a可通过靶定多种周期及凋亡相关蛋白（如CyclinE2、CDK4、C-myc和Bcl-2等）mRNA的3′UTR区而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，使这些蛋白的mRNA降解，使细胞周期不向S期转换，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤的发生[18]。反之，如果miR-34a表达降低，将会导致细胞增殖失控，凋亡抑制，最终形成肿瘤。近来有研究发现P53直接轉录miR-34家族的表达，是P53肿瘤抑制蛋白的直接靶标，在宫颈癌发生中，HPV感染宫颈细胞中，HPV对宿主细胞产生免疫攻击，这种免疫攻击主要是通过HPV基因组整合到宿主细胞，基因组整合后HPV-E6蛋白表达，HPV-E6蛋白靶向P53基因，通过泛素蛋白酶途径降解P53，导致P53有效性降低，P53失活导致可与miR-34结合位点的启动区域的蛋白数量的减少，从而下调大多数被HPV感染的组织中miR-34的表达，导致miR-34a数量降低，因此导致细胞凋亡、G1期阻滞、DNA修复和凋亡的蛋白失活，因此细胞增殖，促进肿瘤的发生。有研究报道，miR-34a表达从宫颈上皮内瘤变到宫颈癌逐渐下调，低的miR-34a水平可能与病毒的整合、E6蛋白的表达及P53缺失有关[19]。

本研究发现，宫颈脱落细胞中，miRNA34a在宫颈癌和高级别宫颈上皮内病变中的表达水平显著低于它们在正常宫颈及低级别宫颈上皮内病变中的表达，且miRAN34a值随着宫颈病变加重逐渐降低，同时在HSIL预测中也能发挥一定的作用。在对HSIL预测中，miRAN34a与Pap相比较，miRAN34a诊断宫颈病变的敏感性，AUC显著高于Pap。提示miRAN34a检测作为生物标记物用于宫颈癌筛查中HPV阳性的妇女的有效分流的潜在临床价值，值得进一步研究。

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收稿日期：2018-6-1;修回日期：2018-6-10

编辑/杨倩